Лактофаги — вирусы бактерий рода Lactococcus — представляют собой весьма обширную и достаточно хорошо изученную группу вирулентных и умеренных фагов. Эти микроорганизмы вызывают неослабевающий интерес исследователей прежде всего из-за экономических издержек, которые несут предприятия молочной промышленности в результате явлений фаголизиса. Поскольку в производстве ферментированных молочных продуктов чаще других используют молочнокислые бактерии Lactococcus lactis, то и фаги, вирулентные по отношению к данным бактериям, распространены на молочных комбинатах наиболее широко. По оценкам зарубежных коллег, до 2/3 всех процессов ферментации осуществляется молочнокислыми бактериями Lactococcus lactis [1], и именно лактофаги являются причиной большинства неудачных технологических ходов при выработке кисломолочных продуктов как в нашей стране, так и за ее пределами [2—4].
Универсальных способов борьбы с фаголизисом до сих пор не существует. Предлагается ряд мероприятий, способных лишь ограничить это явление или научиться распознавать его признаки на ранних стадиях ферментации молока. Наиболее действенная мера — использование фагоустойчивых штаммов заквасочных бактерий, которые приходится селектировать или конструировать практически постоянно, поскольку, как известно, уже в течение 2—3 технологических процессов по отношению к этим бактериям отбираются способные инфицировать их фаги [5].
Основными причинами такой быстрой адаптации лактофагов к новым «хозяевам» являются мутационные события, в результате которых, в частности, возникают вирулентные варианты умеренных фагов и рекомбинационные процессы, стимулирующиеся, как недавно было показано, при частой ротации заквасочных культур на производстве [6]. Таким образом, еще одна особенность лактофагов — очень высокая степень изменчивости и, соответ¬ственно, скорость эволюции. Их популяции на молочных комбинатах пребывают в динамическом состоянии и характеризуются необычайным биоразнообразием [7]. Становится понятным, что для отбора фагорезистентных заквасочных бактерий необходим фаговый мониторинг на предприятиях молочной промышленности, а совершенствование контроля распространения фагов и возможность их своевременного обнаружения немыслимы без изучения свойств этих микроорганизмов.
Целью настоящей работы являлась характеристика фенотипических свойств лактофагов, циркулирующих в настоящее время на молокоперерабатывающих предприятиях Республики Беларусь. Она выполнена в рамках финансируемого задания ГППИ «Новые биотехнологии» по теме «Исследование нуклеотидного состава ДНК фагов лактококков и создание праймеров для быстрого выявления умеренных и вирулентных фагов в составе заквасок и бакконцентратов методом PCR-анализа».
Объектами изучения служили вирулентные по отношению к бактериям Lactococcus lactis фаги, выделенные из различных кисломолочных продуктов отечественного производства. Источники и способы их отбора были описаны ранее [8]. Бактериальными тест-культурами, в клетках которых происходила репродукция лактофагов, служили штаммы Lactococcus lactis из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ, а также сквашивающие молоко бактерии, выделенные из тех же источников, что и фаги.
Определение чувствительности бактериофагов к цитрату
Стерильные растворы цитрата натрия вносили в верхний и нижний агаровые слои в методе Грациа и титровали исследуемые фаги, отмечая их способность формировать негативные колонии. Устойчивость к цитрату определяли как процентное содержание в суспензии фаговых частиц, способных образовывать негативные колонии. Контролем служили аналогичные посевы без добавления цитрата.
Оценка чувствительности фагов к ультрафиолету (УФ)
В качестве критерия чувствительности фагов к ультрафиолету использовали их выживаемость при воздействии УФ в течение 60 с (расстояние источника излучения — лампы БУВ-15 — от объекта составляло 40 см). Фаговые частицы разводили в фаговом буфере до концентрации 1—4•106 БОЕ/мл, вносили по 3 мл суспензий в чашку Петри и облучали при постоянном перемешивании. Титровали суспензии на тест-культурах и подсчитывали число фаговых частиц, сохранивших способность инфицировать бактериальные клетки. Выживаемость определяли как процентное отношение концентрации фагов в опыте к таковому в контроле (суспензия фагов до УФ-облучения).
Микроскопические исследования проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа марки JSM-300, пробы готовили стандартным методом [7]. Негативное контрастирование вирионов осуществляли фосфорно-вольфрамовой кислотой.
В ходе анализа различных молочных продуктов (творог, сметана, сыры, кефир, ряженка, йогурт, глазированные сырки, простокваша, масло, молоко), произведенных в разных регионах Беларуси (крупные и мелкие молочные комбинаты, а также крестьянские хозяйства), было выделено 37 количественно преобладающих штаммов лактофагов. Необходимо отметить, что концентрация бактериофагов в исследуемых продуктах достигала значений 102—106 БОЕ/мл, в наибольшей степени контаминированными оказались твердые сыры, творог и сметана; 27 из 265 образцов содержали вирулентные по отношению к бактериям Lactococcus lactis фаги. Эти результаты свидетельствуют о широком распространении лактофагов на молочных комбинатах республики, что, с одной стороны, обусловливает экономические издержки предприятий, а с другой — вызывает ухудшение качества продуктов и повышает вероятность развития пищевых токсикоинфекций из-за массовой гибели заквасочных лактококков в процессе фаголизиса.
Из негативной колонии каждого морфологического типа отбирали материал и после процедуры расчистки получали чистые линии фагов, у которых анализировали морфологию негативных колоний и спектр литического действия. Именно эти признаки, как наиболее доступные для сопоставления, использовали для разграничения выделенных фагов и отбора типичных изолятов. После отбраковки идентичных и редко встречающихся представителей в коллекции осталось 23 штамма, на основании чего можно заключить, что они количественно преобладают в составе произведенных в Беларуси молочных продуктов, а значит, и наиболее широко распространены на молочных комбинатах республики. В табл. 1 систематизированы основные признаки негативных колоний выделенных лактофагов.
Анализ приведенных в таблице признаков негативных колоний выделенных лактофагов свидетельствует о том, что их морфологическое разнообразие относительно невелико. На рис. 1 представлено несколько фотографий этих колоний, сформированных различными изолятами в двухслойном агаре. Чаще других встречаются 2 морфологических типа фагов, различающихся диаметром данных колоний. К преобладающему относятся фаги, составляющие прозрачные негативные колонии с четко очерченным краем диаметром 2,8—3,6 мм. Ко второму — фаги, создающие аналогичные по морфологии колонии меньшего диаметра (0,6—2 мм). Реже всего в составе проанализированных кисломолочных продуктов встречались фаги, формирующие мутные бляшки с фестончатым краем.
Обнаруженные морфологические различия могли бы быть использованы в качестве маркерных признаков для характеристики отдельных представителей, если бы а) позволяли выявлять среди исследуемой выборки фагов группы, четко разграниченные по отличительным особенностям, и б) не претерпевали существенных колебаний в зависимости от условий эксперимента. Однако, как выяснилось в ходе работы, ни одного из названных условий эти признаки не удовлетворяют. В частности, параллельные эксперименты по титрованию фагов одного и того же штамма на разных тест-культурах показали, что размеры и характер края негативных колоний, а иногда и степень их прозрачности очень сильно зависят от штаммовой принадлежности бактерий-хозяев. Таким образом, становится очевидным условный характер исследуемого признака (морфология негативных колоний), который дает воспроизводимые результаты лишь при использовании в качестве индикаторных культур одних и тех же хозяев и проведении экспериментов в абсолютно одинаковых условиях.
Одной из главных характеристик бактериофагов, которая отражает их индивидуальные отличия, является спектр литического действия — круг бактерий, обеспечивающих репродукцию данного фага. В табл. 2 и на рис. 2 отражены различия в спектрах литического действия исследованных лактофагов.
Приведенные в табл. 2 результаты позволяют заметить, что абсолютно одинаковыми спектрами литического действия характеризуются только следующие пары: Е11 и Е21, Е05 и Е12, а также Е08 и Е18. Остальные фаги отличаются спектрами литического действия. В попытках распределить всю совокупность выделенных фагов по характерным группам, в составе которых можно было бы найти типовых представителей, выбрали своеобразную «точку отсчета» — способность коллекционных лактофагов инфицировать бактерии L. lactis 502 и L. lactis 503 (именно эти «хозяева» отличались наиболее широкими фаготипами). На рис. 2, где отражены фаготипы трех штаммов лактококков (с помощью репликатора на каждый из газонов тест-культур нанесены одни и те же лизаты), можно различить фаги, инфицирующие только L. lactis 502, но не L. lactis 503 (группа 2-с); L. lactis 503, но не L. lactis 502 (группа 3-с), а также бактерии обоих штаммов (группы 1-с и 4-с). В группу 1-с отнесли фаги с широким спектром литического действия, а в группу 4-с — с узким (табл. 2).
Сравнение состава фаговых групп, образованных с использованием двух наиболее доступных для изучения фенотипических признаков, позволяет сделать вывод об отсутствии какой-либо корреляции между морфологией негативных колоний и спектром литического действия лактофагов.
Еще одной фенотипической характеристикой бактериофагов, имеющей таксономическое значение, является их чувствительность к инактивирующим агентам. В качестве одного из них был применен ультрафиолет, который вызывает повреждения в фаговых ДНК, а в качестве второго — цитрат натрия, связывающий ионы кальция и усложняющий адсорбцию частиц на клетках. В табл. 3 представлены данные по выживаемости и инактивации лактофагов под действием этих факторов.
Анализ приведенных в табл. 3 данных позволяет сделать следующие выводы:
• анализируемая выборка фагов достаточно разнородна в отношении устойчивости к инактивирующим агентам: выживаемость фагов после УФ-облучения колеблется в пределах от 0 до 1,2%, а устойчивость к цитрату — от 0 до 16%;
• по степени устойчивости к ультрафиолету можно выделить три группы лактофагов: высокочувствительные (выживаемость в условиях эксперимента 0%), относительно устойчивые (0,1—0,4%) и высокоустойчивые (0,4—1,2%);
• по степени устойчивости к цитрату также можно различить три группы лактофагов: чувствительные (выживаемость 0—1%), относительно устойчивые (1—6%) и высокоустойчивые (7—16%).
Совокупный анализ изученных фенотипических признаков лактофагов показал, что использование для разграничения этих объектов перечисленных выше критериев — мера недостаточная, по¬скольку состав групп, созданных на основании признаков каждой категории, не совпадает ни в одном из случаев. Иными словами, любая группа, образованная по какому-либо критерию из числа изученных, содержит фаги, сильно различающиеся по остальным признакам.
В последнее время все чаще в качестве критерия для дифференцирования и идентификации лактофагов применяют особенности морфологии вирусных частиц [7]. При этом во внимание принимают параметры головки и хвостового отростка, наличие и тип шипов, форму капсида. Пересмотренная и уточненная схема классификации фагов лактококков включает 10 групп (видов) [7], из которых «виновниками» неудавшихся процессов ферментации на производстве чаще всего считают представителей трех видов: Р335, с2 и 936 [4]. Микроскопическое исследование вирионов выделенных лактофагов позволило сравнить их морфологические признаки с опубликованными в литературе [7, 9] и определить их видовую принадлежность (табл. 4, рис. 3).
Можно видеть, что в исследованной коллекции 65% лактофагов (15 из 23) имеют удлиненную головку небольшой величины, что позволяет отнести их к семейству Siphoviridae, виду с2. Фаги с изометрической головкой составляют 35%, причем половина из них (Е03, Е07, Е08 и Е11) обладает длинным отростком и параметрами капсида, сходными с представителями вида 936. Четыре фага (Е09, Е15, Е19 и Е23) характеризуются очень коротким хвостовым отростком и принадлежат, согласно этому морфологическому критерию, к семейству Podoviridae. Таким образом, состав группы лактофагов, наиболее широко представленных в кисломолочных продуктах белорусского производства, имеет свои особенности: преобладают фаги с удлиненной головкой (с2), и достаточно высоко содержание фагов с короткими отростками (Р034). Согласно литературным данным [1, 10], фаголизис на производстве в большинстве случаев вызывают фаги с изометрической головкой, принадлежащие к виду 936, — они насчитывают обычно до половины всех изолятов; четверть относится к с2 и оставшаяся четверть — к гетерогенному виду Р335, представители которого характеризуются маленькой изометрической головкой и могут быть как вирулентными, так и умеренными; фаги семейства Podoviridae обусловливают фаголизис редко.
Следует отметить также отсутствие корреляции между морфологией вирионов и другими исследованными фенотипическими признаками лактофагов. Это легко проследить, например, по отношению к образцам семейства Podoviridae (Е09, Е15, Е19, Е23). Данные фаги существенно отличаются от остальных и достаточно сходны между собой по морфологии вирионов, но попадают в совершенно разные группы, выделенные на основании изучения других фенотипических признаков (табл. 1—3). Это обстоятельство, скорее всего, является следствием высокой изменчивости лактофагов и предопределяет необходимость использования для их классификации множества разнообразных подходов, в том числе на молекулярно-генетическом уровне.
Применение в качестве критерия дифференцирования лактофагов особенностей морфологии их вирионов, несмотря на достаточную трудоемкость и затратность, дает возможность разграничить выборку фагов на четко различающиеся группы, что должно помочь выявить типичных представителей. Секвенирование ДНК и сопоставительный анализ последовательности нуклеотидов в геномах типовых фагов — необходимое условие разработки молекулярных зондов для быстрого обнаружения лактофагов и минимизации последствий фаголизиса на производстве.

Литература
1. Brussow H. Phages of dairy bacteria // Annu. Rev. Microbiol, 2001. 55:283—303.
2. Sanlibaba P, Akcelik M. Classification of virulent lactococcal bacteriophages based on protein composition and restriction endonuclease analysis // Turk J Vet Anim Sci, 2005. С. 865—871.
3. Szczepanska A.K., Hejnowicz M.S., Kolakowski P., Bardowski J. Biodiversity of Lactococcus lactis bacteriophages in Polish dairy environment // Acta Biochimica Polonica, 2007. С. 151—158.
4. Moineau S., Levesque C. Control of bacteriophages in industrial fermentation // Bacteriophages: biology and applications. CRC Press, BocaRaton, Fla, 2005. С. 286—296.
5. Teuber M., Genetic engineering techniques in food microbiology and enzymology. // Food Rev. Int., 1993, №3. С. 389—409.
6. Rakonjac J., O’Toole P.W., Lubbers M. Isolation of Lactococcal Prolate Phage-Phage Recombinants by an Enrichment Strategy Reveals Two Novel Host // J. of Bacteriol. V. 187, 2005, No. 9. P. 3110—3121.
7. Deveau H., Labrie S. J., Chopin M., Moineau S. Biodiversity and classification of lactococcal phages // Applied and Environmental Microbiology, 2006. С. 338—346.
8. Райский А.П., Белясова Н.А., Малечко Е.П. Распространение бактериофагов лактококков в молочных продуктах, произведенных в Республике Беларусь // Труды БГТУ. Сер. IV. Химия и технология органических веществ. Вып. ХIV, 2006. С. 144—146.
9. Ackermann H.-W., Eisenstark A. The present stage of phage taxonomy // Intervirology. Т. 3. 1974. С. 201—219.
10. Prevots F., Mata V., Retzenthaler P. Taxonomic differentiation of 101 lactococcal bacteriophages and characterization of bacteriophages with unusually large genomes. // Appl. Environ. Microbiol, 1990. 56: 2180—2185.

Summary
From samples of the sour-milk products, produced in different regions of Republic of Belarus, 23 phages virulent for bacteria Lactococcus lactis were isolated. For these lactophages morphological features, spectrum of lytic action, inactive agents sensitivity were studied. It was shown, that between the investigated characteristics there is no any correlation, and the most suitable criterion for lactophages differentiation is the morphology of virus particles. Primary classification of isolated phages was made. It was shown, that among phages widespread in Republic of Belarus the members of с2 species from Siphoviridae family are predominate (65%) and that Podoviridae members are constitute an unusual a grate proportion (17,5%). The lactococcal phages characterized here were deposited in the Belorussian collection of nonpathogenic microorganisms.