Коллекция бактериофагов и индикаторных культур молочнокислых бактерий

Наталья Фурик, заведующая сектором селекции бактериофагов рУП «институт мясо-молочной промышленности», кандидат технических наук
Людмила Сафроненко, заведующая отделом микробиологии рУП «институт мясо-молочной промышленности», кандидат технических наук
Наталья Дудко, заведующая лабораторией бактериальных препаратов и заквасок рУП «институт мясо-молочной промышленности»
Екатерина Кононович, инженер сектора селекции бактериофагов рУП «институт мясо-молочной промышленности»

Создание коллекционного фонда бактериофагов и индикаторных культур молочнокислых бактерий в рУП «институт мясо-молочной промышленности» было cвязано с необходимостью получения отечественных фагорезистентных заквасок молочнокислых бактерий (МкБ), используемых для ферментации молока при производстве кисломолочных продуктов и сыров. Бактериофаги — вирусы молочнокислых бактерий — присутствуют не только в молоке, но и в окружающей среде молочных заводов. Пастеризация не убивает их полностью. Фаги вызывают лизис заквасочной культуры или снижают активность молочнокислого процесса, что ухудшает качество и приводит к порче производимых продуктов, употребление которых может стать причиной отравления. известно, что развитие фагов происходит только в живых клетках МкБ, находящихся в стадии роста, и визуально определить наличие вирусов можно лишь с помощью чувствительной (индикаторной) культуры, у которой «взаимоотношения» между фагом и бактериальной клеткой завершаются лизисом последней. для производства традиционных кисломолочных продуктов (сметаны, творога и др.) и сыров особую опасность представляют фаги, лизирующие бактерии рода Lactococcus. Лактококки составляют обязательную и основную часть МкБ, входящих в состав бактериальных заквасок и концентратов. Одним из перспективных направлений борьбы с бактериофагом является применение бакконцентратов фагоустойчивых культур МкБ, отбор которых возможен только при использовании коллекции фагов и индикаторных культур молочнокислых бактерий. для создания такой коллекции выделение вирусов и индикаторных культур МкБ проводили из образцов молочной продукции, отобранной на 33 молокозаводах республики, включая те, где возникала неблагополучная фаговая ситуация.

Методы выделения фагов из образцов молочной продукции и изучение свойств вирусов описаны нами ранее [1]. Выращивание бактериальных культур осуществляли в гидролизованном обрате при 30 °С в течение 16 часов [2]. Спектр литического действия фага и специфичность, которые необходимо учитывать при подборе фагоустойчивых культур МкБ, определяются способностью фага образовывать зоны лизиса на различных бактериальных штаммах. для определения спектра литического действия бактериофагов, циркулирующих на молочных предприятиях Беларуси, и подбора индикаторных культур МкБ использовались штаммы из коллекции промышленных молочнокислых бактерий отдела микробиологии рУП «институт мясо-молочной промышленности», а также лактобактерии, выделенные из природных источников (листьев, цветов растений и т.д.) и производственных заквасок, используемых для изготовления ферментированных молочных продуктов. Определение фагочувствительности отдельных культур проводилось методом агаровых слоев [3]. В чашку заливался слой питательной среды, содержащей 1,5% агара, а сверху — питательная среда с 0,6% агара, инокулированная 0,1%ной тест-культурой. После застывания репликатором наносились фаголизаты с титром бляшкообразующих единиц не менее 1.106 (БОе/см3). когда жидкость впитывалась в агар, посевы на 24 часа помещали в термостат при 30 °С. Образование в местах нанесения капель фаголизата на газоне тест-культуры светлых стерильных пятен (бляшек), так называемых негативных колоний, свидетельствует о чувствительности данной культуры к исследуемому фагу.

к ранее выделенным бактериофагам в качестве хозяина по индексу фагочувствительности и специфичности подбирались индикаторные культуры. из 330 коллекционных штаммов лактобактерий, проверенных нами, фагочувствительными оказались 58. из коллекционных штаммов МкБ отдела микробиологии было отобрано 16 индикаторных культур: 5 штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, 2 штамма
L. lactis subsp. Cremoris и 9 — L. lactis subsp. diacetilactis. Отбор индикаторных культур был проведен среди фагочувствительных лактококков, выделенных на молочных предприятиях республики из образцов производственной закваски. На Березовском, кобринском, Пружанском сыродельных заводах были взяты 6 образцов заквасок и ферментированные ими образцы готовой продукции. Все отобранные производственные закваски протестировали на фагочувствительность. Фагочувствительные варианты заквасок были рассеяны до отдельных колоний для получения чистой культуры и идентифицированы. В качестве индикаторных культур выделили: 1 штамм Lactococcus lactis subsp. lactis, 1 штамм L. lactis subsp. cremoris, 1 штамм L. lactis subsp. diacetilactis. Проведено также выделение индикаторных культур МкБ из природных источников. Первым его этапом являлось обогащение природных образцов молочнокислой микрофлорой. Затем они тестировались на фагоустойчивость, и отбирались наиболее фагочувствительные варианты. из 60 образцов, обогащенных МкБ, фагочувствительными оказались 20, из которых по спектру литического действия для выделения индикаторных культур было отобрано 12. каждый из них рассеяли до изолированных колоний на чашках Петри методом глубинного посева. По 10 колоний от образца повторно тестировали на фагочувствительность, изменения которой в каждом из них представлены на рис. 1. из него видно, что при рассеве образцов были получены штаммы, обладающие разной фагочувствительностью. для дальнейшей работы в рамках одного образца отбирались культуры с большей
Рис. 1. Изменение фагочувствительности отдельных штаммов, полученных из одного образца Примечание. 1—12 — образцы рассева; 1—10 — количество сколотых колоний при рассеве каждого образца
фагочувствительностью, а также с низкой, но со специфическим фаготипом. идентификацию культур проводили в соответствии с апробированной в отделе микробиологии методической схемой селекции и идентификации МкБ и по определителю Берджи [4]. В коллекцию были отобраны: 4 штамма Lactococcus lactis subsp. lactis, 7 штаммов Lactococcus lactis subsp. diacetilactis и 2 штамма Lactococcus lactis subsp. сremoris. В табл. 1 представлены данные по фагочувствительности культур МкБ, выделенных из производственных заквасок и природных образцов.

В результате проведенных исследований была сформирована коллекция индикаторных культур, состоящая из 32 штаммов лактококков, взятых из различных источников, необходимая для определения специфичности бактериофагов и поддержания их жизнеспособности.
из образцов продукции молокозаводов различных регионов страны (сыра, сметаны, творога, кисломолочных напитков)
Таблица 1. Фагочувствительность выделенных индикаторных культур
нами выделено 128 бактериофагов лактококков (табл. 2). После изучения спектра литического действия данные бактериофаги были разделены на три группы. к первой отнесены фаги, которые являются специфическими и лизируют клетки только одной из индикаторных культур. так, фаг №77 лизирует только клетки штамма 83 индикаторной культуры Lactococcus lactis subsp. diacetilactis. Во вторую группу вошли монофаги, лизирующие индикаторные культуры, относящиеся к одной разновидности одного вида. к этой группе принадлежит фаг №96, лизирующий несколько штаммов L. lactis subsp. diacetilactis. В третью группу входят полифаги, лизирующие несколько разновидностей одного вида лактококков или несколько видов одного рода. Фаги, включенные в эту группу, составляют более 90% от общего числа выделенных вирусов.

По количеству лизированных индикаторных культур полифаги были разделены следующим образом:
3,6% фагов лизировали менее 10% индикаторных культур;
5,9% — от 10 до 20%;
10,6% — от 20 до 30%;
8,2% — от 30 до 40%;
9,4% — от 40 до 50%;
21,2% — от 50 до 60%;
15,3% — от 60 до 70%;
21,2% — от 70 до 80%;
4,7% — от 80 до 90%.

Как видно из приведенных данных,62,4% фагов, выделенных на молочных заводах в различных регионах страны, обладают достаточно широким спектром литического действия (лизируют более 50% индикаторных культур). Полученные результаты подтверждают данные российских исследователей о расширении спектра литического действия бактериофагов, циркулирующих в настоящее время на молокозаводах [5].

Известно, что особую опасность в производстве кисломолочных продуктов представляют фаги, которые могут лизировать до 50% штаммов лактококков, используемых в закваске. так как на заводах для обеспечения ассортимента выпускаемой продукции используются одновременно несколько партий поливидовых концентратов МкБ, это приводит к возникновению фагов с новыми, более широкими, спектрами литической активности. Нами и другими исследователями установлено, что фаги, обнаруживаемые на предприятиях с неблагополучной фаговой ситуацией, обладают более широким литическим спектром и повышенной вирулентностью, фиксируемой по скорости лизиса клеток хозяина, по сравнению с фагами, выделяемыми на благополучных по фаговому фону молочных заводах. это свидетельствует о необходимости подбора в состав заквасок МкБ, используемых при производстве кисломолочных продуктов и сыров, фагоустойчивых культур.

В настоящее время коллекционный фонд в рУП «институт мясо-молочной промышленности» насчитывает около 128 штаммов бактериофагов, среди которых имеются как близкие фаги (тестируемые на одних и тех же культурах), так и специфические и 32 индикаторные культуры МкБ. Поддержка жизнеспособности созданного коллекционного фонда фагов и индикаторных культур МкБ осуществляется методами периодического пересева и лиофилизации. Созданная коллекция бактериофагов постоянно используется для мониторинга литической активности по отношению к культурам заквасок МкБ, применяемых для производства кисломолочных продуктов и сыров. Более 40 молокоперерабатывающих предприятий Беларуси выпускают широкоизвестные продукты с использованием концентратов МкБ института мясо-молочной промышленности.

В последнее время растет количество производителей, поставляющих бакконцентраты заквасочных культур МкБ на молочные заводы республики. Поэтому расширяется количество видов бактериофагов, увеличивается спектр их литического действия. это предполагает постоянное обновление коллекции промышленных бактериофагов и индикаторных культур, используемой для подбора фагоустойчивых заквасочных культур для бактериальных концентратов, которые применяются для производства высококачественных кисломолочных продуктов и сыров.

Удк 637.146.33: 576.858.9

Литература

1. Фурик Н.Н., Богданова Л.Л., Сафроненко Л.В. изучение свойств вирулентных бактериофагов промышленных штаммов лактококков, используемых в сыроделии // Весцi НаН Беларусi. Сер. бiял. навук, 2003, №3. С. 113—116.

2. Банникова Л.а., королева Н.С. Микробиологические основы молочного производства. — М., 1987. С. 143—147, 296.

3. Габрилович и.М. Практическое пособие по бактериофагии. — Мн., 1968. С. 18—19, 79—87.

4. Определитель бактерий Берджи. — М., 1997, т. 2. С. 538, 549—550.

5. Ганина В.и., Лешина В.С., Смирнова т.а. Характеристика бактериофагов, выделенных из молочных продуктов, вырабатываемых различными предприятиями, молочной промышленности / Сб. Получение, свойства и применение молочно-белковых и растительных концентратов. — М., 1991. С. 131—134.

Summary

In the Institute of Meat and Dairy Industries a collection of 128 lytic bacteriophages of Lactobacterium and 32 indicator cultures of Lactobacterium was created. The collection is referred to when selecting phague-resistant Lactobacterium for bacterial ferments used in sour-milk goods and rennet cheese production.