Укоренение in vitro и ex vitro подвоя вишни и черешни

Возможность укоренения плодовых и ягодных культур в условиях ex vitro вызывает большой интерес в области сельскохозяйственной биотехнологии. Он связан с ускорением процесса микроразмножения и снижением затрат при получении оздоровленного посадочного материала. Использование торфа в качестве субстрата для ex vitro ризогенеза растений сорта черешни Kristiina, предварительно обработанных 0,3%-й индолилмасляной кислотой (ИМК), привело к 56% укоренения [7]. Регенеранты земляники садовой, укорененные в условиях ex vitro в минеральной вате (Grodan), пропитанной раствором Plant Starter, характеризовались превосходством в морфологическом и физиологическом развитии по сравнению с укоренными в условиях in vitro [5]. Успешно проводят укоренение в условиях ex vitro на ионообменных субстратах
«БИОНА» регенерантов картофеля и отечественные ученые [3].
Целью данного исследования было изучение возможности ex vitro ризогенеза регенерантов подвоя вишни и черешни GiSelA 5 с использованием ионообменного субстрата «БИОНА-112», а также сравнение морфофизиологического развития растений, укорененных в условиях in vitro и ex vitro.
Объектом изучения являлся клоновый подвой GiSelA 5 (Cerasus vulgaris х C. canescens), в условиях in vivo характеризующийся как трудноукореняемый. Использовались субстраты:
• агаризованная среда 1/2 MS+0,4 мг/л ИМК (для ризогенеза in vitro);
• «БИОНА-112» (для ризогенеза ex vitro) —
ионообменный субстрат на основе катионита КУ-2 (Н+) и анионита ЭДЭ-10П (ОН?) в соотношении 1:2,05, насыщенных различными макро- и микроэлементами в ионообменном виде (рН-водной вытяжки из ИОС — 6,05). Для эксперимента выбрали летний период, когда у регенерантов отмечалась наименьшая способность к ризогенезу.
Исследования проходили в три этапа:
I. Ризогенез in vitro или ex vitro (длительность — 6 недель). Укоренение растений, полученных после культивирования на модифицированной среде MS + 1 мг/л 6-бензиладенина + 2 мг/л гибберелловой кислоты, осуществляли в конце июня. Наши более ранние исследования на этапе ризогенеза in vitro показали, что в этот период наблюдается наименьшая способность регенерантов к образованию корневых зачатков.
II. 1-й этап адаптации ex vitro (длительность — 8 недель). Растения, укорененные в условиях in vitro, на адаптацию пересаживали на субстрат «БИОНА-112», а ex vitro — на торфяной субстрат, который представлял собой смесь субстрата «Флорабел-5» и песка речного в соотношении 3:1, проавтоклавированную при давлении 1,2 атм. в течение 2 часов.
III. 2-й этап адаптации (постадаптация) проводили на торфяном субстрате (длительность — 16 недель).
Морфологическое развитие растений оценивали по следующим морфометрическим показателям в 3-кратной повторности: длина стебля (см), количество листьев (шт.), площадь листовых пластинок (мм2) (высчитывали в программе Image-Pro Plus 5.1) и их масса (г), эффективность укоренения, объем корневой системы [1]. Учитывали число укорененных или прижившихся растений (%).
Показатель «эффективность укоренения» высчитывали по следующей формуле: Nкорней х Lкорней/10, где Nкорней — количество корней на растение; Lкорней — средняя длина корней (см) [4].
Физиологическое развитие оценивали по результатам биохимического анализа листьев растений (в 4-6-кратной биологической повторности): содержание хлорофиллов а и b; растворимых сахаров (моносахара и сахароза); сухого вещества (гравиметрический метод) [2, 4].
Условия ризогенеза: освещение — 2,5—3 тыс. люкс, температура — +21—23°С; адаптации: освещение — 2,5—3 тыс. люкс, температура — +20—22°С, фотопериод — 16/8 часов.
В результате исследований на I этапе было отмечено, что в условиях ex vitro количество укорененных регенерантов составило 40%, что в 2,2 раза меньше, чем при in vitro укоренении на агаризованной питательной среде. Однако даже этот невысокий процент показал саму возможность ризогенеза растений вишни в нестерильных условиях. При изучении морфологических аспектов отмечено, что средняя длина корней, образовавшихся при использовании ионообменного субстрата в условиях ex vitro, с высокой степенью достоверности выше по сравнению с корнями, сформировавшимися в стерильных условиях (табл. 1). В то же время наибольшее образование основных корней наблюдалось in vitro. Для оценки влияния методов укоренения на степень развития корневой системы мы использовали показатель «эффективность укоренения». У регенерантов, укорененных в условиях ex vitro, он был выше в 2 раза.
Растения, укорененные на ИОС, характеризовались значительным усилением роста надземной части (рис. 1) по сравнению с укорененными на питательной среде MS, что наряду с увеличением степени развития корневой системы приводило к получению более развитых укорененных регенерантов. Однако усиленный вегетативный рост не сопровождался биохимической активностью, что отмечено в результате биохимического анализа листьев регенерантов. Укорененным регенерантам в условиях ex vitro свойственно низкое содержание фотосинтетических пигментов в единице массы листовой пластинки по сравнению с укорененными на питательной среде в условиях in vitro (табл. 2).
Резкое снижение концентрации пигментов, с нашей точки зрения, объясняется усилением вегетативного роста и наложением адаптационного стресса, а также переходом растений на автотрофный тип питания, перестройкой фотосинтетической системы. Коэффициент отношения Хл а/b у регенерантов, укорененных в ex vitro условиях, составил 2,35, в условиях in vitro — 1,99. Первые регенеранты характеризовались значительным увеличением общего объема корневой системы по сравнению со вторыми.
Таким образом, нами показана возможность ризогенеза ex vitro трудноукореняемого подвоя GiSelA 5 на ионообменном субстрате «БИОНА-112», то есть совмещения этапов укоренения и адаптации в нестерильных условиях. Невысокая результативность ризогенеза ex vitro может быть преодолена оптимизацией минерального и, возможно, гормонального составов ИОС.
Для растений, укорененных in vitro, II этап исследований был адаптационным к условиям ex vitro. В течение него 11,1% растений погибло. Ex vitro укорененные растения адаптировались к традиционному субстрату. Они отлично перенесли смену ионообменного субстрата на торфяной, и приживаемость составила 100%. В среднем морфометрические показатели развития надземной части (длина стебля, параметры развития листовых пластинок: количество листьев, площади и масса листовых пластинок) были выше у ex vitro укорененных растений (табл. 3).
Рост корневой системы обусловливался методом укоренения. Наиболее развитая она была у растений, укорененных в условиях ex vitro за счет интенсивного роста в длину и большого количества боковых корней.
Накопление фотосинтетических пигментов (Хл а и b, каротиноидов) в единице массы листовой пластинки на II этапе исследований активно проходило в листьях растений, укорененных в ex vitro условиях (табл. 4). При пересчете на целое растение наблюдали более существенные различия в биохимических показателях опять-таки в пользу последних.
Концентрация пластических веществ также была выше у ex vitro укорененных растений, а содержание моносахаров достоверно не зависело от метода укоренения. В целом растении, укорененном в условиях ex vitro, сахаров было в 2 раза больше, а количество сухого вещества — практически одинаковое для различных условий укоренения (табл. 5). Таким образом, на II этапе исследований ex vitro укорененные растения в морфологическом и физиологическом развитии опережали укорененные в условиях in vitro.
На 2-м этапе адаптации также отмечалось влияние методов укоренения на развитие растений подвоя, пересаженного на торфяной субстрат. Максимальные морфометрические показатели наблюдались у растений, укорененных в ex vitro условиях (табл. 6), а укорененные в условиях in vitro после II этапа исследований ex vitro на ионообменном субстрате все прижились при пересадке на торфяной субстрат.
Таким образом, после 16 недель культивирования на торфяном субстрате растения, укорененные в условиях ex vitro, в морфологическом развитии превышали таковое у растений в условиях in vitro.
На биохимический состав листьев подвоя GiSelA 5 также достоверно оказывали поствлияние методы ризогенеза. Содержание Хл а и суммы хлорофиллов а и b на единицу массы у растений, укоренных на питательной среде с 0,4 мг/л ИМК, была выше, чем у растений другого варианта (табл. 7). Однако в целом в растении концентрация Хл а и суммы хлорофиллов a и b незначительно отличались между укорененными в стерильных и нестерильных условиях. Подвергнутые ex vitro укоренению характеризовались достоверно большим содержанием Хл b и каротиноидов как в единице массы, так и при пересчете на целое растение. Стоит отметить, что синтез каротиноидов на протяжении двух этапов адаптации интенсивней проходил у растений, укорененных в условиях ex vitro.
Таким образом, их фотосинтетическая система имела невысокое содержание Хл а в единице массы по сравнению с in vitro укорененными и в то же время больший потенциал к дальнейшему синтезу этого пигмента, так как известный своими свойствами Хл b преобладал в листьях ex vitro растений.
Исследование динамики накопления хлорофиллов а и b на трех этапах эксперимента позволяют сделать вывод, что у ex vitro укорененных растений отмечается плавное изменение концентраций каротиноидов и хлорофиллов, в то время как у in vitro укорененных данный параметр меняется скачкообразно. По-нашему мнению, это свидетельствует о возможном физиологическом стрессе регенерантов.
Концентрация пластических веществ в единице листовой массы на 2-м этапе адаптации отличалась незначительно. В целом содержание сахаров было больше в растениях, укорененных в условиях ex vitro: моносахаров — в 1, 7 раза, сахарозы — в 1,5, суммы сахаров — в 1,6 раза (табл. 8). Таким образом, концентрация пластических веществ к концу III этапа исследований не зависела от того, в каких условиях проводилось укоренение.
Сухое вещество накапливалось достоверно больше в условиях ex vitro. Несмотря на то, что после 1-го этапа адаптации содержание сухого вещества было практически одинаковым (25,7% — in vitro, 27,5% — ex vitro), на 2-м растения, укорененные ex vitro, обладали значительно большим содержанием сухого вещества (52,9%), чем in vitro укорененные (43,1%).
В связи с тем, что на этапе постадаптации содержание сахаров не зависело от условий укоренения, а сухого вещества у ex vitro укорененных растений отмечалось больше, можно предположить, что в последних идет не только накопление сахаров, но и интенсивная транспортировка их на построение растительного организма. Из сказанного можно заключить, что:
• показана возможность укоренения в условиях ex vitro растений трудноукореняемого клонового подвоя GiSelA 5 на ионообменном субстрате «БИОНА-112»;
• растения, укорененные в ex vitro условиях, превосходят в морфологическом развитии укорененные стандартным методом in vitro и готовы к высадке в грунт для доращивания на 16 недель раньше;
• накопление фотосинтетических пигментов интенсивней проходит в растениях, укорененных в условиях ex vitro: они быстрее адаптируются к новым условиям произрастания на этапе укоренения, переживая возможный физиологический стресс, проявляющийся в снижении количества хлорофиллов и каротиноидов в единице массы, а не на этапе адаптации, как это наблюдается у растений, укорененных в условиях in vitro.

Литература
1. Викторов Д.П. Малый практикум по физиологии растений. — М., 1983, С. 60—62.
2. Карманенко Н.М., Казанцева О.Ф. Колориметрический метод определения сахаров в растительном материале // Агрохимия. 1986, №1. С. 107—110.
3. Матусевич В.В., Семенова З.А., Хирсанова И.Ф. Размножение оздоровленного картофеля микрочеренкованием in vivo на ионитных субстратах различного состава // Картофелеводство: науч. труды, вып. 9. — Мн., 1997. С. 136—142.
4. Методы биохимического исследования растений / под ред. д.б.н. А.И. Ермакова. — Л., 1987.
5. Borkowska B. Morphological and physiological characteristics of micropropagated strawberry plants rooted in vitro or ex vitro // Scientia Horticulture, vol. 89, 2001. P. 195—206.
6. Jiang Hujun, Pan Jishu, Men Xinfa The study of meristem-tip culture of peach (Prunus persica L.) // Acta Agr. Univ. Pekin., vol. 19, № 1, 1993. P. 49—52.
7. Vasar V. Effect of ascorbic acid and citric acid on ex vitro rooting and acclimatization of Prunus avium L. microshoots // Acta Hort., v. 616. 2003. P. 251—254.

Summary
Ex vitro rooting opportunity of hardrooting rootstock GiSelA 5 regenerants in ion-exchange substrate BIONA-112 was established at the first time. Ex vitro rooted plants in BIONA-112 formed the good root system and the above-ground part of the plants after all researching stages (in vitro or ex vitro rooting, ex vitro adaptation, post-adaptation). Replacing the standard in vitro rooting stage by ex vitro rhizogenesis makes it possible to obtain plantlets with full biological functions and good morphological and physiological development, which ready for transferring in greenhouse on 16 weeks earlier than in vitro rooted plants. The process of rhyzogenesis and adaptation to unsterile conditions occurred at the ex vitro rooting concurrently.