Распределение NO-позитивных нейронов в головном мозге рыб и земноводных

Валерий Дунай, заведующий кафедрой психофизиологии гуманитарного факультета Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук
Сергей Мельнов, проректор по научной работе Международного государственного экологического университета, доктор биологических наук, профессор
Борис Лысый, доцент кафедры анатомии, физиологии и валеологии Белорусского государственного педагогического университета им. М. танка, кандидат медицинских наук

Цель данной работы — изучение распределения NO-позитивных нервных клеток в головном мозге рыб и земноводных как представителей анамний.
Литературные данные свидетельствуют, что NO, выделяемый CNO-позитивными нервными клетками, участвует в становлении структуры и функции нервной системы в онтогенезе [1], а также принимает участие в центральной регуляции большинства физиологических функций взрослого организма [2, 3, 4]. Однако, несмотря на это, филогенез и онтогенез центральной NO-ергической системы и ее роль в развитии функциональных систем остаются малоизученными.

В экспериментальной части работы использованы 20 взрослых особей карпа чешуйчатого (Cyprinus carpio, надкласс рыбы) и 20 взрослых особей лягушки озерной (Rana ridibunda, класс земноводные). Названные животные относятся к анамниям, так как у них в процессе эмбриогенеза не возникает зародышевой оболочки (амниона) и особого зародышевого органа (аллантоиса) и они связаны в своем существовании с водной средой.

У карпа и лягушки после извлечения головного мозга выделяли изучаемую структуру: продолговатый, средний, промежуточный и передний мозг.
Специальными исследованиями было доказано, что нейронная синтаза NO (CNO) является никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат-диафоразой [5]. Во-первых, локализация в центральной и периферической нервной системе НадФН-д-содержащих нейронов, окрашенных гистохимически, соответствует локализации нервных клеток, содержащих CNO, окрашенных с применением методов иммуногистохимии. Во-вторых, CNO и НадФН-д обнаруживают сходные иммунохимические и биохимические свойства. В-третьих, НадФН-д-активность выявляется de novo у клеток с трансформированной кдНк к CNO. использование гистохимической реакции на НадФН-д для идентификации CNO-содержащих нейронов возможно только при условии, что исследуемая ткань проходит фиксацию в параформальдегиде. Установлено [5], что при фиксации с параформальдегидом инактивируются все НадФН-зависимые ферменты-окислители, за исключением CNO. таким образом, при условии фиксации ткани в параформальдегиде проведение гистохимической реакции на НадФН-д для идентификации NO-синтезирующих нервных клеток является адекватным методом, широко применяемым в настоящее время.

В работе использован метод идентификации НадФН-д-содержащих нейронов, разработанный Scherer-Singler [6], в модификации Hope и Vincent [7].
У животных целиком извлекали головной мозг. Отделяли изучаемые структуры и дополнительно их фиксировали, согласно рекомендации Matsumoto [8], 90 мин. в 4%-ном параформальдегиде на фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,4). Участки мозга шесть раз по 30 мин. отмывали на холоде с использованием 0,1 М раствора трис-НСl (pH 8,0) и инкубировали в 10- и 25%ном растворах сахарозы на трис-НСl (0,1 M, pH 8,0) в течение 1,5 и 12 часов соответственно.
Объекты помещали на охлажденные металлические блоки, которые ставили в криостат (–25 °C) на 20 мин. для замораживания. из замороженной ткани готовили серийные срезы толщиной 25 мкм, которые наклеивали на предметные стекла, предварительно подвергшиеся хром-желатиновой обработке, и высушивали.

Срезы отмывали от сахарозы в 0,1 М растворе трис-НСl (pH 8,0) в течение 5 мин. Гистохимическая процедура заключалась в инкубации срезов в растворе 0,1 М трис-HCI (рН 8,0), содержащем НадФН (1 мМ), нитросиний тетразолий (0,5 мМ), тритон X-100 (0,3%) и дикумарол (0,1 мМ) на протяжении 1—2 часов при 22 °C и относительной влажности 95—100%. По окончании гистохимической реакции срезы промывали в растворе трис-НСl в течение 5 мин., обезвоживали в этаноле, заключали в канадский бальзам и накрывали покровными стеклами.

Специфичность гистохимической реакции проверялась инкубацией нескольких срезов в растворах, не содержащих нитросиний тетразолий или НадФН, а также в растворе, содержащем НадФ вместо НадФН. Химическая основа реакции заключается в образовании преципитата формазана при восстановлении солей тетразолия НадФН-диафоразой (CNO) в присутствии НадФН. таким образом, гистохимическая реакция не должна наблюдаться в случае отсутствия в инкубационной среде любого из основных компонентов (нитросиний тетразолий, НадФН), а также в случае использования НадФ вместо НадФН.

При микроскопическом исследовании срезов головного мозга карпа, окрашенных на НадФН-д/СNO, установлено, что все его изучаемые структуры содержат НадФН-д/СNO-позитивные нейроны.
При изучении продолговатого мозга, окрашенного на НадФНд/СNO, установлено, что НадФН-д/СNO-позитивные нервные клетки имеют небольшие размеры — 6—12 мкм, плотность их расположения — 48—64 в мм2.
В среднем мозге карпа наблюдается увеличение размеров нервных клеток, содержащих до 10—16 мкм НадФН-д/СNO. Однако плотность их расположения невелика — 12—20 в мм2.

НадФН-д/СNO-позитивные нервные клетки в переднем и заднем отделах гипоталамуса имеют размеры 6—10 мкм, плотность их расположения — 22—34 в мм2 (рис. 1).

НадФН-д/СNO-позитивные нервные клетки у карпа обнаружены в переднем мозге, нейроны слабоокрашенные, мелких размеров (4—6 мкм), с невысокой плотностью расположения (2—6 в мм2).

Головной мозг лягушки также содержит НадФН-д/СNO-позитивные нейроны во всех изучаемых структурах.

Установлено, что НадФН-д/СNO-позитивные нервные клетки продолговатого мозга у лягушки имеют размеры 10—16 мкм, плотность их расположения — 74—82 в мм2.

В среднем мозге лягушки наблюдаются НадФН-д/СNO-содержащие нейроны размером 8—14 мкм. Плотность их расположения — 18—26 в мм2.
Передние и задние отделы гипоталамуса лягушки содержат слабоокрашенные НадФН-д/СNO-позитивные нейроны мелких размеров (6—10 мкм), плотность их расположения — 40—48 в мм2 (рис. 2).

При изучении срезов переднего мозга лягушки, окрашенных на НадФН-д/СNO, установлено наличие в них НадФН-д/СNO-пози

Рис. 3. Количество НАДФН-д/СNO-позитивных нервных клеток в продолговатом мозге карпа и лягушки в мм2
тивных нейронов размером 6—12 мкм. Плотность расположения — 4—12 в мм2.

Таким образом, установлено, что все изучаемые структуры головного мозга карпа и лягушки содержат НадФН-д/СNO-позитивные нервные клетки. В продолговатом мозге у исследованных животных наблюдалось большее количество НадФН-д/СNO-содержащих нейронов по сравнению с другими изученными отделами мозга. также обнаружено увеличение количества НадФН-д/СNO-содержащих нейронов в продолговатом мозге земноводных по сравнению с рыбами (рис. 3).

Предпосылкой к постановке задач настоящего исследования служили развиваемые представления о том, что NO, синтезируемый нервными клетками, может участвовать в развитии структуры и функции цНС, являясь эффекторной молекулой, вызывающей гибель определенных клеточных структур, а также играя важную роль в механизмах роста нервных окончаний и формирования синаптических контактов. Процесс эволюции сопровождается усложнением организации нервной системы. для понимания филогенеза центральной NO-ергической системы представляло интерес изучить распределение НадФН-д/СNO-позитивных нервных клеток в головном мозге рыб и земноводных как организмов, сохранивших тесную связь с водной средой.

Доказано, что в продолговатом мозге у исследованных животных наблюдалось большее количество НадФН-д/СNO-содержащих нейронов по сравнению с другими изученными отделами мозга. также установлено увеличение количества НадФН-д/СNO-содержащих нейронов в продолговатом мозге земноводных по сравнению с рыбами. Учитывая, что NO является одним из важнейших факторов, обеспечивающих развитие нервной системы, можно предположить, что увеличение количества НадФН-д/СNO-содержащих нейронов в продолговатом мозге коррелирует с морфо-функциональным усложнением продолговатого мозга земноводных по сравнению с рыбами, что также связано с изменениями в дыхательной и сердечно-сосудистой системах и, как следствие, с выходом на сушу предков современных земноводных.

Удк 575.321/.322:616.831

Литература

1. Dawson T.M., Hwang P.M., Snyder S.H. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1991, vol. 88, №17. P. 7797—7801.

2. Gourine A.V. Role of nitric oxide in lipopolysaccharide-induced fever in conscious rabbits // J. Physiol, 1994, vol. 475. P. 28.

3. Amir S., De Blasio E., English A. M. NG-Monomethyl-L-arginine co-injection attenuates the thermogenic and hyperthermic effects of E2 prostaglandinmicroinjection into the anterior hypothalamic preoptic area in rats // Brain Res, 1991, vol. 556. P. 157—160.

4. Dunai V.I. Development of the central NO-ergic systems in ontogenesis of maturenate mammals // Basic and Applied Thermophysiology, Minsk, 2000. P. 183—184.

5. Pasqualotto B.A., Hope B.T., Vincent S.R. Citrulline in the rat brain immunohistochemistry and coexistence with NADPH-diapho-rase // Neurosci. Lett, 1991, vol. 128, №2. P. 155—160.

6. Scherer-Singler U., Vincent S.R., Kimura H., McGeer E.G. Demonstration of a unique population of neurons with NADPH-diaphorase histochemistry // J.Neurosci.Methods, 1983, vol. 9, №3. P. 229—234.

7. Hope B.T., Vincent S.R. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase // J. Histochem. Cytochem, 1989, vol. 37. P. 653—661.

8. Matsumoto T., Kuk J.E., Forstermann U. A correlation between soluble brain nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase activity is nly seen after exposure of the tissue to fixative // Neurosci. Lett, 1993, vol. 155, №1. P. 61—64.

Summary

The aim of this work was studying of the distribution of NADFH-d/СNO-positive nervous cells in brain with fishes and Amphibia such as representatives of anamnes.
It has been positioned that all of studying structures of the brain of carp and frog have NADFH-d/СNO-positive nervous cells. In intermediate brain with the investigationed animals it was observed a lot of numbers NADFH-d/СNO neurons in the comparing with other studied parts of the brain. Also it was positioned increasing of numbers NADFH-d/СNO neurons in intermediate brain with Amfibia with the comparing with fishes.
Key words: onthogenesis, NO-synthasa, hypotalamus.