В рандомизированных клинических исследованиях (ALLHAT [1, 2], VALUE [3], ELVERA [4], PREVENT [5], CAPARES [6], CAMELOT [7] и др.) показано, что применение амлодипина у больных с артериальной гипертензией приводит к значительному снижению как диастолического, так и систолического артериального давления и обратному развитию гипертрофии левого желудочка, а также снижению риска развития сердечно-сосудистых осложнений. Уровень убедительности доказательств клинической эффективности – А. В ходе упомянутых исследований были получены также подтверждения возможности торможения атеросклеротического процесса в коронарных сосудах на фоне длительного лечения амлодипином (PREVENT, CAPARES). В сравнительном исследовании CAMELOT показаны преимущества антагониста кальция амлодипина по сравнению с ингибитором АПФ эналаприлом в лечении пациентов с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца благодаря наличию выраженного антиангинального, антиишемического и антиатеросклеротического эффектов.
Одним из основных препятствий к широкому применению в клинической практике современных антигипертензивных препаратов является их высокая стоимость. Разработка и внедрение на фармацевтический рынок Беларуси отечественного препарата-генерика позволит существенно расширить имеющийся в распоряжении практического здравоохранения республики арсенал новейших высокоэффективных лекарственных средств для специфической антигипертензивной терапии, а также значительно снизить стоимость лечения пациентов. В рамках реализации задач импортозамещения на РУП «Белмедпрепараты» разработали генерический препарат «Амлодипин, таблетки 5 мг».
Решением Фармакологического комитета Минздрава Республики Беларусь (Протокол заседания №3 от 31.03.2008 г.) и распоряжением Минздрава Республики Беларусь №01-03-09/3227 от 15.04.2008 г. были назначены сравнительные клинические испытания биоэквивалентности данного лекарственного средства на базе 4-й городской клинической больницы Минска.
Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики, предназначенной для определения содержания амлодипина в плазме крови при выполнении испытания биоэквивалентности.
Валидация методики количественного определения амлодипина в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводилась в лаборатории технологии биологически активных веществ отдела разработки и внедрения технологий фармацевтических субстанций РУП «Белмедпрепараты».
Процедура валидации методики выполнена на образцах, полученных методом твердофазной экстракции из плазмы крови, содержащей амлодипин (Maprimed, Аргентина). В качестве внутреннего стандарта применяли ремантадин (China).
В работе использовали следующие реактивы: ацетонитрил для ВЭЖХ, метанол для ВЭЖХ, калий дигидрофосфат (ч.д.а), натрия дигидрофосфат (ч.д.а), аммиак (о.с.ч.), кислоту хлористоводородную (ч.д.а), кислоту ортофосфорную (о.с.ч.), триэтиламин (для ВЭЖХ), кислоту борную (ч.д.а.), 4-хлоро-7-нитро-бензофуразан (NBD-CI) (для ВЭЖХ).
Анализ проводили на жидкостном хроматографе «SHIMADZU UFLC», оснащенном вакуумным дегазатором, двумя градиентными насосами модели LC-20AD XR, автосамплером SIL-20AC XR, термостатом и флуориметрическим детектором модели RF-10AXL.
Для построения калибровочных кривых и проведения валидационных испытаний были приготовлены образцы с заданным содержанием амлодипина в плазме крови, полученной в РНПЦ гематологии и трансфузиологии. Образцы были приготовлены путем внесения в точно отмеренный объем плазмы определенного объема (меньше 5% объема плазмы) рабочих растворов амлодипина соответствующей концентрации. Полученные растворы аликвотировали и замораживали при температуре минус 220С. Рабочие растворы амлодипина готовили разбавлением метанолом промежуточных растворов. Промежуточные растворы были приготовлены из исходного раствора амлодипина в метаноле 1 мг/мл.
Выделение амлодипина из плазмы крови и очистку экстракта осуществляли методом твердофазной экстракции. Для приготовления образцов использовали вакуумную систему для твердофазной экстракции фирмы Agilent и картриджи для твердофазной экстракции SamplyQ C2 (Agilent).
Картриджи для твердофазной экстракции предварительно уравновешивали: 2 мл ацетонитрила, затем 1 мл воды, далее на картридж добавляли 2,5 мл 25 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,0. На картриджи наносили 3 мл пробы, содержащей 2 мл плазмы и 1 мл раствора внутреннего стандарта ремантадина (30 нг/мл в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0). Затем картриджи промывали 2 мл 20%-ного ацетонитрила и 1 мл ацетонитрила, амлодипин и внутренний стандарт экстрагировали 2,5 мл 2,5%-ного аммиака в ацетонитриле. Пробы выпаривали под вакуумом. Сухой остаток растворяли в 200 мкл метанола.
К 200 мкл метанольных растворов, полученных после твердофазной экстракции образцов, прибавляли 200 мкл 0,2 М боратного буфера (рН = 8,6) и 200 мкл метанольного раствора NBD-Cl (0,5 мг/мл). Перемешивали при 480 об/мин в течение 5 мин. После этого пробирки помещали на водяную баню на 15 мин. (800С). Пробирки охлаждали и добавляли 200 мкл 2 М НСl. Центрифугировали 1 мин. при 3000 об/мин. Полученный образец использовали для хроматографического анализа.
Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Purospher STAR RP-18, 125?4,0 мм, 5 мкм (Merck). Элюирование проводили в градиентом режиме при температуре 620С, подвижная фаза подавалась со скоростью 2 мл/мин. В качестве подвижной фазы А использовали 50 мМ раствор натрия дигидрофосфата, содержащий 1 мл/л триэтиламина, рН 2,5; подвижной фазы Б – метанол. Объем вводимой пробы образца составлял 20 мкл. Детектирование осуществляли при длине волны возбуждения 470 нм, эмиссии 537 нм. Хроматограммы были получены и обработаны на программном обеспечении LC solution.
На рис. 1 представлена типичная хроматограмма образца плазмы, содержащего амлодипин.
Хроматографические параметры разработанной методики: время удерживания – 3,6 мин. для амлодипина и 6,9 мин. для ремантадина (внутреннего стандарта); эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику амлодипина, составила более 4000 теоретических тарелок, по пику ремантадина – более 18000 теоретических тарелок; фактор асимметрии для пика амлодипина – 0,9, для пика ремантадина – 1,0; коэффициенты емкости исследуемых компонентов составили 2,7 и 5,9 для амлодипина и ремантадина соответственно. Степень извлечения амлодипина – 93% (для концентрации 30 нг/мл), степень извлечения внутреннего стандарта (ремантадина) – 99,5%. Пики исследуемого компонента (амлодипина) и внутреннего стандарта (ремантадина) достоверно детектируются и надежно отделяются как друг от друга (разрешение более 5), так и от эндогенных компонентов образца плазмы.
Валидацию методики количественного определения амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ проводили в соответствии с «Guidance for industry. Bioanalytical method validation», US DHHS, FDA, CDER 2001 [8] «Reviewer Guidance. Validation of chromatographic methods», CDER, 1994, и Государственной фармакопеей Республики Беларусь [9].
В ходе валидационных испытаний исследовали избирательность, линейность, воспроизводимость, внутрилабораторную воспроизводимость и правильность, оценили предел количественного определения методики, исследовали стабильность образцов в автосамплере, а также стабильность амлодипина в биоматериале при комнатной температуре. Кроме того, определили степень извлечения амлодипина и внутреннего стандарта (ремантадина) из биологического материала.
При оценке избирательности с целью определения степени влияния эндогенных компонентов плазмы крови на хроматографирование производных амлодипина и ремантадина после предварительной дериватизации были проанализированы образцы плазмы крови 6 различных доноров, не содержащие амлодипин и ремантадин. На полученных хроматограммах отсутствуют пики, совпадающие со временем удерживания пиков производных амлодипина и ремантадина (рис. 2).
Для оценки линейности были построены калибровочные кривые, связывающие отношения площади пика производного амлодипина к площади пика производного ремантадина и различную концентрацию амлодипина (0,5, 1, 4, 8, 16, 24, 32 и 40 нг/мл) в плазме крови. Методом наименьших квадратов с помощью программного обеспечения построено 8 линейных зависимостей отношения площадей пиков производных амлодипина и внутреннего стандарта к концентрации амлодипина в плазме крови. Наименьшее значение коэффициента корреляции составило 0,989, что удовлетворяет критерию приемлемости (не менее 0,97). Рассчитаны средние значения отношений площадей пиков производных амлодипина и внутреннего стандарта. Относительные стандартные отклонения (RSD, %) для каждой из концентраций удовлетворяют критерию приемлемости (не более 10% для всех точек, кроме точки, близкой к пределу количественного определения, для которой значение RSD не более 15%). По средним значениям отношений площадей пиков производных амлодипина и внутреннего стандарта построена линейная зависимость для расчета концентрации амлодипина в плазме крови добровольцев. На рис. 3 приведен график зависимости средних значений отношений площадей пиков амлодипина и ремантадина от концентрации амлодипина в плазме крови. Зависимость носит линейный характер в диапазоне концентраций 0,5–40 нг/мл и описывается линейным уравнением y = 14,19x c коэффициентом корреляции 0,999.
Оценку правильности и прецизионности методики проводили при повторных анализах на трех уровнях концентраций амлодипина в плазме – 1,5; 12 и 30 нг/мл – как в один, так и в разные дни. Результаты исследования приведены в табл. 1.
Предел количественного определения методики оценивали как минимальную концентрацию лекарственного средства, при которой соотношение сигнал/шум составляет около 10:1 и значение RSD не превышает 20%. Он оказался равен
0,5 нг/мл.
В процессе выполнения аналитического этапа исследования биоэквивалентности лекарственного средства хроматографическому анализу подлежит большое количество образцов. В связи с этим в аналогичных работах, как правило, используют хроматографические комплексы, оснащенные устройством для автоматического ввода проб (автосамплерами). Однако это возможно лишь при стабильности исследуемых образцов при температуре, поддерживаемой автосамплером Результаты исследования стабильности образцов при 150С (температура, поддерживаемая в автосамплере) демонстрируют стабильность исследуемых проб как минимум 24 часа (табл. 2).
Разработанная методика определения амлодипина в плазме крови сочетает в себе выделение амлодипина из образца при помощи процедуры твердофазной экстракции, упаривание экстракта, дальнейшую дериватизацию образца для получения флуоресцирующего производного, а затем непосредственно хроматографический анализ. Так как пробоподготовка образцов для анализа является достаточно трудоемкой и длительной, необходимо оценить стабильность амлодипина в биологическом материале при комнатной температуре хранения. Стабильность образцов плазмы крови, содержащей амлодипин, при комнатной температуре хранения оценивали по величине отношения площадей пиков производных амлодипина и ремантадина через определенные интервалы времени относительно исходного соотношения площадей, в процентах.
Были приготовлены образцы амлодипина в плазме крови с концентрацией 1,5, 12 и 30 нг/мл. Часть проб сразу после приготовления была подвергнута процедуре экстракции и дериватизации, проанализирована на хроматографе (0 часов). Оставшаяся часть проб хранилась 2, 4 и 6 часов при комнатной температуре. Далее проводили экстракцию, дериватизацию и хроматографический анализ. Установлено, что амлодипин стабилен в растворе плазмы крови человека по крайней мере в течение 6 часов (среднее значение процента восстановления соотношений площадей пиков через 6 часов по отношению к исходным значениям составило 98,5, 102,2
и 101,92% для концентраций амлодипина в плазме крови 1,5, 12 и 30 нг/мл соответственно).
Степень извлечения компонентов из биологического материала. Степень извлечения амлодипина из плазмы крови в процессе экстракции (%) оценивали по соотношению площадей пиков производных амлодипина, полученных при анализе образцов плазмы крови, содержащих три различные концентрации амлодипина и модельных метанольных растворов амлодипина аналогичных концентраций, не подвергавшихся процедуре экстракции. Среднее значение степени извлечения составило 102,5, 98 и 93% для концентраций 1,5, 12 и 30 нг/мл соответственно, RSD – 9,4, 9,1 и 6,8% соответственно. Оценка степени извлечения внутреннего стандарта (ремантадина) представлена в табл. 3. В целом валидационные характеристики разработанной методики, определенные в ходе исследования, приведены в табл. 4.
Таким образом, доказано, что разработанная методика количественного определения содержания амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ воспроизводима и позволяет получить достоверные результаты.
Методика была применена для изучения биоэквивалентности препарата «Амлодипин, таблетки 5 мг» (РУП «Белмедпрепараты») в сравнении с препаратом «Норваск, таблетки 5 мг» (производства компании «Пфайзер»). Результаты проведенных исследований [10] подтвердили биэквивалентность данных лекарственных средств. Препарат «Амлодипин, таблетки 5 мг» зарегистрирован в Реестре лекарственных средств Республики Беларусь (рег. № 10/04/1726 от 29.04.2010 г.).