Биомедицинский потенциал холодно­плазменной технологии

В общем комплексе различных методов лечения, применяемых в медицине, находят место и физические факторы.
В их ряду вакуумно-плазменные технологии, в частности, связанные с генерацией плазмы тлеющего разряда (ПТР), которая является разновидностью низкотемпературной и низкоэнергетической («холодной») плазмы. Уже сообщалось о биотропном эффекте, обнаруженном у излучений ПТР [1, 2]. Возможно, он связан с воздействием на живые системы генерированного ПТР электромагнитного излучения низкой интенсивности. Имеется целый ряд гипотез относительно механизмов взаимодействия такого вида излучений с биологическими системами. Вырисовываются и конкретные направления использования ПТР в медицинской практике.
Современная медицина характеризуется активным внедрением в клиническую практику высоких технологий диагностики и лечения. Назовем хотя бы интервенционные технологии, которые послужили стимулом для начала интенсивных работ в области микромеханики, материаловедения, биотехнологии и др. Более того, уже сейчас просматривается будущая киборгизация человека, которая потребует максимального совмещения имплантируемых электромеханических и электронных устройств с его естественными тканями. Для создания имплантатов и подобных медицинских изделий применяются титан и его сплавы, а также другие материалы, обладающие определенной биосовместимостью. Свойства материалов играют особую роль, так как недостаточная биосовместимость может привести к негативным реакциям на имплантат со стороны окружающих тканей, вызывая воспалительные процессы, дисфункции эндотелия, нарушения гемостаза, деструкции и некроз костной ткани и т.д. [3, 4]. Снизить частоту развития негативных процессов позволяют гидрофильные покрытия, модификация химического состава и топографии поверхности имплантатов. Попытки сконструировать их следующие поколения сфокусированы на создание уникальной нанотопографии поверхности и основаны на подражании природе, поскольку натуральные ткани – костная, фиброзная, эндотелий – определенным образом наноструктурированы. Например, титан и его сплавы, будучи обработанными раствором NaOH, могут формировать на своей поверхности способствующие соединению с костной тканью ядра кристаллизации фосфатов кальция, имитирующие гидроксиапатит (Ca5[PO4]3OH2), входящий в состав костной ткани, после иммерсии в соответствующие перенасыщенные растворы. Многие исследования показали эффективность использования вакуумно-плазменной технологии в таких процедурах для повышения биосовместимости и стойкости (механической, химической) имплантационных материалов после модификации их поверхностных свойств [5–7]. В частности, это продемонстрировано на экспериментальных моделях методом pull-out в работе [6].
Для исследования биосовместимости имплантационных материалов часто проводятся опыты in vitro с культурами различных клеток – фибробластов, лимфоцитов, макрофагов и эпителиальных клеток. Разработаны тесты in vitro с бактериальными клетками [8]. Влияние материала оценивают по таким показателям, как адгезия, изменение морфологических свойств, ингибирование роста клеточной популяции, угнетение метаболической активности и др.
Нами изучены поверхностные свойства, включая биосовместимость, ряда материалов, используемых в медицине, после воздействия ПТР . Полированные диски или пластинки из титана и его сплавов, нержавеющих сталей подвергались обработке в специально сконструированном плазмогенераторе при напряжении 1-10 кэВ. Интенсивность облучения была 1017 ионов ? см-2. Температура образцов контролировалась в процессе облучения и не превышала 343 К, время облучения варьировалось от 5 до 60 мин.
Для исследования физических изменений поверхности образцов после облучения была использована резерфордовская спектроскопия обратного рассеяния.
Клеточная адгезия к образцам была тестирована с помощью культуры клеток L929 (мышиные фибробласто-подобные клетки) и клеток белой крови (моно- и полинуклеаров) здоровых и больных людей. Время инкубации образцов, помещенных в клеточные суспензии, составляло 60 мин при 37°С. Характер адгезии изучался с применением сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и люминесцентной микроскопии.
В качестве примера на рис. 1 приведены полученные резерфордовские спектры необлученного (а) и облученного (б) в ПТР образцов титана, из которых следует, что на поверхности облученных образцов появляется железо, обязанное своим происхождением высокоуглеродистой стали катода и процессу вторичной эмиссии. Это можно рассматривать как иллюстрацию возможности модификации поверхности образцов излучениями ПТР. Процентное содержание железа и толщина слоя были рассчитаны по программе RUMP Simulation. Эти данные, а также показатели адгезии мышиных фибробластов на контрольных и облученных образцах титана, полученные с помощью СЭМ, представлены в табл. 1.
В аналогичном исследовании по повышению биосовместимости титана обработкой радиочастотной плазмой показано с помощью атомно-силовой микроскопии, рассеяния и дифракции рентгеновского излучения, рентгеновской фотоэлектронной микроскопии внедрение или покрытие поверхности обработанных образцов ионами О, С, N остаточного воздуха [7].
Адгезия клеток, как известно, играет исключительно важную роль в биологических процессах, а именно: в формировании тканей и органов в ходе эмбриогенеза, в репарационных процессах, в иммунных и воспалительных реакциях, а также других физиологических и патологических событиях.
Характерной особенностью фибробластов, клеток иммунной системы и клеток, участвующих в воспалении, является способность к передвижению. Причем у иммуноцитов и лейкоцитов она заключается не только в свободной рециркуляции с током крови или лимфы, но и в пенетрации сосудистой стенки и активной миграции в окружающие ткани. Локомоции клеток предшествует их прикрепление и распластывание на подложке. Степень распластывания – важный подготовительный шаг амебоидной подвижности клеток на поверхности. Хотя имеются сведения, что они не всегда совпадают [9]. Обычно такая рассогласованность наблюдается при некоторых патологиях, и факт этот необходимо учитывать.
Анализ клеточного прикрепления в нашем случае выявляет более высокую степень адгезии клеток к облученной поверхности. Имеется в виду не только сам акт прилипания и его процент, но и распластывание клеток, на что указывает показатель увеличения (инкремент) площади прикрепившихся клеток у облученных образцов в сравнении с контролем. Кроме того, из данных, представленных в табл. 1, следует, что более выраженная адгезия соответствует тем образцам, которые подвергались облучению максимальное время, даже при минимальном напряжении. Хотя у этих образцов зарегистрировано меньшее количество железа (и толщины слоя) по сравнению с теми, что подвергались облучению в плазмотроне с более высоким напряжением, но более короткое время. Этому факту ниже мы уделим особое внимание.
Здесь для последующей интерпретации полученных результатов необходим краткий экскурс в теорию физики твердого тела, касающийся характера воздействия генерируемых ПТР ускоренных ионных потоков на поверхность облучаемого материала. При зажигании тлеющего разряда в вакууме (в среде остаточных газов) при достижении критических значений напряженности электрического поля ЕС и давления РС возникает стационарный режим существования плазмы с постоянной концентрацией ионов. При напряженности ЕС = 5–8х103 В/м (разность потенциалов между электродами U = 2,5 кВ, расстояние между электродами d = 0,3–0,5 м) и РС = 1–6 Па энергия ионов не превышает 2,5х103 эВ (средняя энергия ионов находится в пределах 300…700 эВ). В этих условиях в кристаллах (металлах, сплавах), диэлектриках и полупроводниках, помещенных в прикатодную область, под воздействием тлеющего разряда происходят существенные изменения физических, химических и механических свойств, являющиеся следствием коллективной перестройки исходного конденсированного состояния. Не анализируя в деталях процессы воздействия быстрых частиц на поверхность материалов (тепловые процессы, физико-химические реакции адсорбции и десорбции, поверхностную миграцию атомов, распыление материала, ионную имплантацию и т.д.), укажем только, что в облучаемых материалах под влиянием интенсивного внешнего воздействия возникают принципиально новые пространственные структуры, устойчивые к малым возмущениям [10, 11].
Дальнейшее поведение материалов после прекращения воздействия низкоэнергетической плазмы определяется величиной и характером поступившей в них энергии различных видов – электрической, механической, тепловой и т.д. Учитывая, что после воздействия весь объем материала пронизан участками с сильно возбужденным конденсированным состоянием, мы вправе ожидать эффект объемного деформационного упрочнения в кристаллических материалах при приложении к ним механической нагрузки и, вследствие этого, повышение износостойкости изделий, работающих в условиях трения (в том числе и эндопротезов). Можно предполагать также резкое изменение химической и электрической активности участков неравновесных структур с сильно возбужденным состоянием.
Таким образом, наше исследование позволяет утверждать, что более эффективным приемом в повышении биосовместимости титана путем воздействия ПТР является физико-химическая модификация его поверхности не столько интенсивностью воздействия, сколько его длительностью – пусть даже с меньшими энергиями.
Ранее проведенные металлографические исследования на различных материалах (технически чистое железо, титан, сплавы на основе железа, титана и т.д.) показали, что при достаточно большом разнообразии исходных структур у них под воздействием тлеющего разряда формируется принципиально новое состояние, характеризующееся возникновением диссипативных неравновесных структур [12, 13]. Энергетическое состояние материалов после облучения можно уподобить состоянию инверсной заселенности в лазере. Система может самопроизвольно релаксировать в состояние равновесия, имея в запасе большой набор различных периодов релаксации. При этом поведение системы в целом определяется процессом с наиболее долгоживущей составляющей, имеющей самое большое из возможных времен релаксации. Иными словами, переход облученных материалов в равновесное состояние, то есть распад неравновесных структур, сопровождается рассеянием поглощенной энергии. Возможно, что эта энергия и определяет особенности поведения живых клеток вблизи энергорассеивающей поверхности. По крайней мере, в исследовании биосовместимости титана и его сплавов после обработки радиочастотной плазмой (близкой по энергетическим характеристикам ПТР) было обнаружено снижение у облученных образцов значений контактного (краевого) угла смачивания ? их поверхности с 67° до 4–6°, приводящее к резкому возрастанию ее гидрофильности [7]. Это, безусловно, не может не отра-зиться на адгезии взаимодействующих с такими поверхностями живых клеток и, соответственно, их структурно-функциональном состоянии [14].
Для проверки этого предположения описанный эксперимент воспроизвели, имея в качестве образца пластинки из сплава на основе железа (нержавеющая сталь марки 12Х18Н10Т), а в качестве тестового объекта – клетки белой крови (лимфоциты и лейкоциты) относительно здоровых и больных людей с ишемической болезнью сердца (ИБС), артериальной гипертензией, атеросклерозом. Но предварительно мы убедились в том, что обработанные ПТР образцы действительно становятся энергизированными и энергорассеивающими. В соответственно поставленном эксперименте они засвечивали в темноте (при 24-часовой экспозиции) при прямом контакте панхроматическую фотопленку (рис. 2), а в дальнейшем было установлено, что они таким же образом засвечивают и фотобумагу. Из этого факта следует, что излучение обработанных образцов низкоинтенсивное, не является инфракрасным, а скорее относится к оптическому диапазону или даже имеет более высокую энергию.
На рис. 3 представлены микрофотографии адгезировавших к облученной и необлученной пластинам лимфоцитов и гранулоцитов крови здорового человека. Как видно из снимков, клетки, находящиеся на разных образцах, существенно различаются морфологически. У лейкоцитов и лимфоцитов, прикрепившихся к облученному материалу, индуцируется не только способность к распластыванию, но и выраженная амебоидная подвижность, что следует из их морфологии.
В большинстве случаев эндопротезирование проводится далеко не у самых здоровых людей, когда их защитно-адаптационные системы обычно разбалансированы и истощены. Этот факт очень важен, и его необходимо учитывать. На рис. 4 отражены результаты аналогичного исследования ядерных клеток крови человека, страдающего артериальной гипертензией II ст., ИБС и атеросклерозом.
Из представленных материалов следует, что на характер адгезии клеток к подложке влияет как физико-химическое состояние этой подложки, так и состояние организма – хозяина клеток и, естественно, самих клеток. Это обстоятельство определяет еще более жесткие требования к материалу имплантатов и, как уже говорилось, должно учитываться. Важен еще один обнаруженный факт. Локомоция, как уже отмечалось, характерна для полиморфноядерных лейкоцитов, поскольку является неотъемлемым атрибутом их специфической функциональной активности и проявляется в ответ на поступающую из окружающей среды информацию химической или физической природы. У лимфоцитов же подобная способность проявляется in vivo, по-видимому, лишь в процессе пенетрации в сосудистую стенку. Возникновение такой способности связано, как известно, с модификацией физико-химического состояния плазматической мембраны клеток, их цитоскелета, ионного баланса, уровня метаболизма (то есть мобилизацией энергетического и пластического ресурса клетки), что in vivo характерно для антигенной либо гормональной стимуляции. Обнаруженный нами феномен, безусловно, заслуживает дальнейшего изучения, а пока ограничимся лишь констатацией факта функциональной активации клеток на поверхности материала, подвергшегося воздействию ПТР.
Имеется множество разнообразных химических соединений и физических факторов, которые, действуя на клеточные поверхности, вызывают различные физические эффекты. Здесь нас интересуют прежде всего физические явления, присутствующие в иммунологических феноменах. Агглютинация, фагоцитоз, лизис, преципитация, адгезия и узнавание – все это не только биологические, но и в первую очередь физические процессы, так как они обусловлены действием физических сил на определенные объекты, а не перестройкой химических связей. Все эти процессы на молекулярном уровне происходят при участии сил Ван-дер-Ваальса, без образования ковалентных связей.
Как известно, на твердой поверхности ускоряются многие химические реакции, которые в жидкой или газовой фазе протекают с малыми скоростями. Также процессы в поверхностных слоях определяют силы трения и адгезии. Явления физики поверхностей еще редко рассматриваются в биомедицинском аспекте, хотя они в значительной степени определяют, как мы видим, биосовместимость, снижение или повышение адгезии в процедурах вживления протезов, использовании контактных линз, изготовлении и применении вакцин и т.д.
Настоящее и предыдущие наши исследования позволяют предполагать, что обработка излучениями ПТР изменяет поверхностную энергию различных материалов, включая воду, что не может не сказываться на состоянии биологических объектов. Поэтому вырисовывается задача дальнейшего изучения поверхностных явлений в биологических реакциях – это определение границы между доминированием неспецифических физических взаимодействий, с одной стороны, и специфическим узнаванием – с другой.
Известно, что при поглощении бактериальной (или любой другой) клетки фагоцитом происходит изменение свободной энергии поверхности ?Gs на единицу площади контакта в момент прилипания бактерии к фагоциту в соответствии с уравнением

?GS = ?ФБ - ?ФС - ?БС, (1)

где ? – свободная межфазная энергия на границе фаз «фагоцит–бактерия» (ФБ), «фагоцит–среда» (ФС) и «бактерия–среда» (БС). Знание этих величин позволяет вычислить ?GS – изменение энергии поверхности. Если величина ?GS положительная, то прилипание бактерии к фагоциту не происходит без участия других дополнительных взаимодействий; при отрицательной величине ?GS оно происходит спонтанно, если этому не мешают другие взаимодействия. Адгезия иммунокомпетентных клеток к твердой поверхности является не чем иным, как частным случаем фагоцитоза, когда предпринимается попытка захвата клеткой объекта, в данном случае поверхности (с участием биологических механизмов), и происходит поэтому с изменениями межфазной свободной энергии соответствующих систем (рис. 5), подчиняясь, следовательно, тем же закономерностям, как и в случае фагоцитоза.
Одна из важнейших характеристик системы веществ, имеющих общую поверхность раздела, – коэффициент поверхностного натяжения

?12 = ?G12 / ?S, (2)

так как он отражает энергетическое состояние этой поверхности, а следовательно, и ее физико-химические свойства. Еще одной важной характеристикой подобных систем является работа, необходимая для разделения поверхности раздела веществ единичной площади на две поверхности раздела (в нашем случае типа «твердое вещество /подложка/ – жидкость /клетка, которая на 90% жидкость/ или жидкость /клетка/ жидкость /культуральная среда/»), то есть работа адгезии

W12 = ?1 + ?2 – ?12 . (3)

Энергетической характеристикой любой поверхности, в том числе и клеточной, может служить также краевой (контактный) угол смачивания ? (рис. 5). С его помощью можно оценивать константы равновесия таких физических процессов, как фагоцитоз и клеточная адгезия. При наличии жесткого условия ?2 << ?1

?12 ? ?1 – ?2 cos ? , (4)

W12 ? ?2 . (1 + cos ?). (5)

Этот случай как раз и соответствует границе раздела фаз «твердое вещество – жидкость». Учитывая тот факт, что эти величины соотносятся с энергиями молекулярного взаимодействия, следует признать, что значения краевого угла смачивания ? действительно позволяют судить об энергетическом состоянии границы раздела веществ 1 и 2 и могут быть, в свою очередь, соотнесены с биологическими эффектами [15].
Таким образом, адгезировавшие на энергорассеивающую поверхность обработанных в ПТР металлов иммуноциты и клетки, участвующие в воспалении, способны улавливать рассеиваемую энергию и вовлекать ее в биологические процессы. Следовательно, применение подобных материалов в медицинской практике обеспечивает контактирующим с ними тканям и клеткам термодинамическое и/или кинетическое преимущество в адгезии, то есть биосовместимости, по сравнению с обычными материалами, что, надо полагать, повысит клиническую эффективность соответствующих процедур. Обнаруженный феномен, безусловно, требует более глубокого теоретического осмысления, тем более что возникающие вопросы выходят далеко за рамки настоящей работы и представляют самостоятельную проблему.