Ввиду быстрого роста ассортимента товарной продукции в различных отраслях промышленности все чаще применяют вместо нативных крахмалов их разнообразные модификаты с целенаправленно измененными (заданными) свойствами. Целевые свойства крахмалы приобретают после обработки химическими, физическими, физико-химическими или биохимическими способами [1, 2].
Перед наукой и производством Республики Беларусь стоит проблема создания отечественных, оригинальных и высокоэффективных технологий получения модифицированных крахмалов. Для разработки и внедрения подобных технологий требуется проведение длительных, трудоемких и дорогостоящих научных исследований, основанных на правильном понимании механизма модификации, в том числе химической. Изучение этого процесса и стало целью данной работы.
Объектом исследования являлись нативный кукурузный, гороховый, пшеничный, тапиоковый, сорговый, рисовый, ячменный, тритикалевый, ржаной, нутовый крахмалы, а также картофельный, выработанный из различных сортов клубнеплодов. Изыскание проводилось при помощи светового микроскопа Zeiss Axiostar plus и цифровой фотокамеры Panasonic DMC-LZ1, рентгеновского дифрактометра HZG 4A.
Результаты исследования представлены на рис. 1–3 и в табл. 1 и 2.
Известно, что нативный крахмал (С6Н10О5)n представляет собой смесь двух полимеров – амилозы (длинные неразветвленные спиралевидные цепи, содержащие от 100 до 2000 ?-D-глюкопиранозных остатков, соединенных ?-(1,4)-гликозидными связями) и амилопектина (множество коротких и разветвленных полиглюкозидных цепочек, каждая из которых содержит ? 17–26 остатков ?-D-глюкопиранозы; в пределах каждой короткой цепи глюкозные остатки соединены ?-(1,4)-, а друг с другом ?-(1,6)-гликозидными связями – ? 5% всех гликозидных связей амилопектина), мономером которых является ?-D-глюкопираноза в конформации «кресло» (рис. 1). В зависимости от происхождения молекулярная масса амилозы колеблется в пределах 105–106, а у амилопектина составляет ? 107–108 [3].
В растительной клетке полисахариды объединены в дискретные крахмальные гранулы, содержащие 15–25% амилозы и 75–85% амилопектина. Они имеют овальную, сферическую или неправильную форму и диаметр ? 0,002–0,15 мм. Их разделяют на простые – однородные образования и сложные – сочетание мелких частиц [3].
Существуют различные гипотезы структурной организации крахмальных гранул. Модель Дональда объясняет формирование кристаллических областей путем совместной кристаллизации макромолекул амилозы с боковыми цепями амилопектина [4]. Согласно Гидли, кристаллические ламели образованы упорядоченной фракцией амилопектина, а цепи амилозы, ориентированные поперек направления чередования ламелей, образуют аморфные области [5]. Последние исследования подтверждают гипотезу о том, что связанные цепи амилозы распределены и в аморфных, и в кристаллических ламелях и при этом отдельные из них в кристаллической области образуют одномерные структуры – «нити», а в аморфной части имеют неупорядоченную структуру [4, 6, 7].
В зависимости от дифракционной картины рентгентоструктурного анализа крахмальные гранулы подразделяют на А-, В- и С-тип. К А-типу относится крахмал зерновых злаков (кукуруза, рис, пшеница), к В-типу – крахмал клубней и луковиц (канна, лилия, картофель), а к С-типу – крахмал промежуточного строения (бобы, батат).
В настоящее время полагают, что реально в природе существуют только А- и В-тип крахмала, так как при смешивании крахмальных гранул А- и В-типа можно получить различные дифракционные картины в зависимости от их соотношения, в том числе и характерные для крахмала С-типа [3].
Известно, что у нативного крахмала А-цепи амилопектина образуют двойные спирали, которые упакованы в кристаллические ламели (кластеры), а В-цепи обеспечивают соединение кластеров. Точки разветвления А- и В-цепей находятся в аморфной ламели. Молекулярная архитектура аморфных колец в настоящее время не вполне известна. Предполагают, что молекулы амилозы и амилопектина находятся друг с другом в неупорядочной конформации [8, 9]. В полукристаллических кольцах разветвленные молекулы амилопектина организуются в кристаллическую структуру второго уровня и аморфную ламель [10].
Суммарная толщина кристаллической и аморфной ламелей для всех крахмалов составляет примерно 9–10 нм [11, 13–15], а толщина кристаллической ламели для амилопектиновых и нормальных крахмалов – 5–6 нм, тогда как аморфной ламели – 3–4 нм [11, 13]. Переход от нормальных к высокоамилозным крахмалам (то есть содержание амилозы в которых превышает 50%) сопровождается увеличением толщины кристаллической ламели и, соответственно, уменьшением аморфной ламели [11, 16–19] при неизменных размерах кластера. Высокое содержание амилозы в высокоамилозных крахмалах приводит к существенным изменениям в кристаллической структуре гранул: уменьшается не только их поверхность, но и общая кристалличность внутри и ее тип [20]. Считается, что амилопектиновые крахмалы зерновых культур обладают А-типом кристаллической решетки, в то время как высокоамилозные крахмалы – В-типом [19, 21, 22], хотя существуют и другие точки зрения [23–25]. Вопрос о типе кристаллической решетки в высокоамилозных крахмалах продолжает обсуждаться.
Сложность кристаллической структуры высокоамилозных крахмалов подтверждается калориметрическими исследованиями. Кривые плавления высокоамилозных крахмалов, как правило, очень широкие и асимметричные [16, 17, 19, 26]. Это значит, что их кристаллические структуры содержат разные типы кристаллов с широким распределением их по размерам [27, 28]. В-тип кристаллической структуры является менее плотной кристаллической формой, обладающей большим количеством воды, чем А-тип. Известно, что крахмалы, содержащие В-тип кристаллов, характеризуются более высокой температурой плавления и проявляют большую резистентность к разрушению под действием ферментов. Методом ядерно-магнитного резонанса показано, что большая часть амилозы присутствует в аморфной форме [20], меньшая существует в виде неагрегированных двойных спиралей, которые термостабильны, обладают большой энтальпией ассоциации за счет связывания водородными связями и для полной солюбилизации требуют высокой температуры и/или давления.
Для оценки нативных крахмалов при проведении фазового анализа предложено ввести коэффициент сродства к модифицирующему химическому фактору (критерий – относительная степень аморфности). Именно аморфные участки гранул в первую очередь подвергаются атаке химического агента, так как к беспорядочно и рыхло расположенным полимерным цепям легче всего получить доступ.
Установлено, что нативные крахмалы в соответствии с коэффициентом сродства к модифицирующему химическому фактору в ряду по убыванию располагаются следующим образом (рис. 2, табл. 1): ячменный, гороховый – кукурузный – нутовый – ржаной – тритикалевый – картофельный картофеля (сорт «Sonate» – сорговый, картофельный (бессортовой картофель) – пшеничный – картофельный («Лелека») – картофельный («Albatros») – картофельный («Kranich») – картофельный («Kormoran» и «Лазарь») – картофельный («Сузорье») – картофельный («Дзвiн») – тапиоковый, рисовый – картофельный («Лилея») – картофельный («Атлант», «Маг» и «Явар») – картофельный («Ласунок») – картофельный («Веснянка») – картофельный («Уладар») – картофельный («Лазурит») – картофельный («Скарб»).
К имеющимся кристаллическим областям крахмальной гранулы, в которых полимерные цепи плотно упакованы, напротив, получить доступ очень сложно. Для проникновения туда химического агента требуется предварительное набухание гранулы, происходящее в результате попадания в нее молекул воды. В процессе набухания происходит разрыхление плотно упакованных полимерных цепей крахмала в кристаллических областях, в результате которого они становятся частично доступны для воздействия химического агента.
Кроме степени кристалличности важным критерием сродства к химическому модифицирующему фактору, по-видимому, является еще и размер крахмальной гранулы (табл. 2, рис. 3). Мелкие гранулы имеют большую поверхность соприкосновения с внешней средой и, как следствие, могут лучше подвергаться атаке химического агента, однако они плохо набухают. Потенциально в них может проникнуть небольшое количество молекул воды, в результате чего в меньшей степени проявляется эффект разрыхления плотно упакованных полимерных цепей крахмала, находящихся в ее кристаллических участках.
Вероятно, именно крупные гранулы крахмала имеют большее сродство к химическому модифицирующему фактору. В них проникает большее количество молекул воды, способствующих разрыхлению кристаллических участков. Кроме того, в пространстве крупных и хорошо набухающих гранул может потенциально находиться большее количество молекул химического агента, осуществляющего атаку.
На рис. 3 показан предлагаемый нами механизм химической модификации в крахмальной грануле. Так, изначально в грануле нативного крахмала имеются как кристаллические, так и аморфные участки. Особенности аморфно-кристаллического строения гранулы обусловлены прежде всего генетически, а также условиями, в которых она формируется. В крахмальной грануле имеются связанные молекулы воды, количество которой зависит от особенностей технологии получения крахмала.
Химическая модификация, как правило, осуществляется в водной среде. Вначале происходит набухание крахмальной гранулы, в результате которого в нее проникают свободные молекулы воды и молекулы растворенного в воде химического агента. Иногда в качестве растворителя используют органическое вещество при химической модификации.
При достижении определенного критического момента набухания гранулы (то есть при критическом содержании молекул воды и химического агента), по-видимому, начинается процесс разрыхления кристаллических участков, что делает их доступными для воздействия химического агента и усиливает химическую модификацию. Процесс разрыхления кристаллических участков катализируется при повышении температуры.
Следует сказать, что полное разрушение кристаллических участков гранулы (то есть ее клейстеризация) нежелательно, так как после этого крахмал становится нетехнологичным: трудно обезвоживается, плохо сушится и т.д.
Наблюдать за протеканием химической модификации и изучать ее механизм можно также по накоплению в крахмале заряженных функциональных групп. Если в результате модификации крахмальные зерна приобретают негативный или позитивный заряд, они могут окрашиваться полярными красителями. У нативного крахмала также имеются разнообразные функциональные группы несущие заряд (-Н, -ОН, -СОН, -СООН и др.), на которых способны адсорбироваться молекулы ионных красителей. Анионный крахмал окрашивается положительно заряженными красителями: метиленовым синим, кристалличным фиолетовым, малахитовым зеленым, метиловым зеленым, сафранином, нейтральным красным, а катионный – адсорбирует отрицательно заряженные красители: светло-зеленый SF желтый, кислый фуксин, оранжевый G.
В качестве временных препаратов нами использовалась водная суспензия (0,3%) неокрашенного и окрашенного крахмала (5 мин. в 0,1%-ном метиленовом синем). При приготовлении препаративных срезов крахмальных гранул сухой крахмал заливали 8%-ным раствором целуидина, наносили на деревянные блоки, высушивали в парах хлороформа и разрезали при помощи микротома. Срезы выдерживали 5 мин. в 0,1%-ном растворе метиленового синего, промывали, высушивали на воздухе и заливали канадским бальзамом [29].
Интенсивность окрашивания разных видов крахмала и отдельных гранул метиленовым синим не одинакова (рис. 4). Она зависит от количества заряженных групп, которые несут на себе отдельные гранулы. Чем их больше, тем темнее окрашивание. Окрашивание нативного крахмала также возможно благодаря наличию фосфатов. Картофельный нативный крахмал довольно сильно окрашивается, поскольку имеет большое количество остатков фосфорной кислоты, а кукурузный практически не окрашивается, что свидетельствует про низкое содержание в нем фосфатов. Гранулы химически модифицированного крахмала окрашены всегда более интенсивно, чем нативного.
Установлено, что крахмальная гранула окрашивается неоднородно (рис. 4). Это свидетельствует о различном содержании заряженных групп, а также о разной интенсивности протекания реакций в разных областях одной и той же гранулы.
Зная характер упаковки полисахаридных молекул и распределение цепей амилопектина в разных областях гранулы, можно утверждать, что более интенсивно окрашиваются аморфные области гранулы модифицированного крахмала поскольку:
? фосфаты, которые влияют на окрашивание, находятся преимущественно в В-цепях амилопектина (их более всего в аморфных областях);
? химическому агенту легче атаковать амилопектин в неплотно упакованных аморфных областях, и по этой причине в них имеется большее количество заряженных карбонильных групп.
Подтвердить слоистую структуру гранул картофельного крахмала можно лишь на окрашенных срезах. Для выявления в крахмальных гранулах мест с наиболее интенсивным протекание химических реакций (то есть с большим количеством заряженных групп) готовились продольный и поперечный срезы крахмальной гранулы.
Также для исследования структуры гранул можно получить их «срезы» более простым методом – просто раздавив гранулу предметным стеклом. Полученные препараты также позволяют оценить степень окрашивания разных участков гранулы и определить, в каких ее участках более интенсивно протекают реакции химической модификации.
Таким образом, аморфные участки, в которых крахмальные гранулы расположены беспорядочно и рыхло, в первую очередь подвергаются атаке химического агента. Интенсивность окрашивания разных видов крахмала и отдельных гранул метиленовым синим разная и зависит от количества заряженных групп, которые несут на себе гранулы.
Для оценки нативных крахмалов при проведении фазового анализа предложено ввести коэффициент сродства к модифицирующему химическому фактору (критерий – относительная степень аморфности). Нативные крахмалы в соответствии с коэффициентом сродства к модифицирующему химическому фактору в ряду по убыванию располагаются следующим образом: ячменный, гороховый – кукурузный – нутовый – ржаной – тритикалевый – картофельный (сорт «Sonate») – сорговый, картофельный (бессортовой картофель) – пшеничный – картофельный («Лелека») – картофельный («Albatros») – картофельный («Kranich») – картофельный («Kormoran» и «Лазарь») – картофельный («Сузорье») – картофельный («Дзвiн») – тапиоковый, рисовый – картофельный («Лилея») – картофельный («Атлант», «Маг» и «Явар») – картофельный («Ласунок») – картофельный («Веснянка») – картофельный («Уладар») – картофельный («Лазурит») – картофельный («Скарб»). Важным критерием сродства к химическому модифицирующему фактору также является размер крахмальной гранулы.