Реорганизация генома тритикале

Тритикале (Ч Triticosecale Wittmack, AABBRR или AABBDDRR) является синтетическим гибридным видом, полученным в результате скрещивания пшеницы (T. durum L. или T. aestivum L.) с рожью (Secale sp.). В последние годы наблюдается значительный интерес к данной культуре как с научной, так и прикладной точки зрения. Это объясняется тем, что она хорошо адаптируется к неблагоприятным условиям окружающей среды, обладает толерантностью к различным заболеваниям и имеет высокий потенциал продуктивности, сочетая в своем генотипе положительные свойства родительских видов — пшеницы и ржи. Однако с расширением посевов тритикале стало очевидным, что она, как и другие зерновые, страдает от болезней и иных неблагоприятных факторов. Кроме того, качество зерна, его хлебопекарные свойства также нуждаются в дальнейшем улучшении. Одним из немаловажных моментов, сдерживающих селекцию этой культуры и широкое внедрение в производство, является узость ее генофонда. Генетическое разнообразие форм пшенично-ржаных амфидиплоидов ограничивается современным видовым и сортовым составом пшеницы и ржи при сочетании, как правило, полнокомплектных геномов того и другого рода. Для селекционного улучшения тритикале предпринимаются попытки введения в ее геном дополнительных источников изменчивости методом отдаленной гибридизации.
Создание линий тритикале, маркированных генами Vrn
На пути решения проблемы экологической адаптации тритикале в условиях Беларуси важно выяснить генетические причины позднеспелости, определяемой преимущественно системой генов Vrn, обусловливающей яровой или озимый тип развития.
Фенотипическая экспрессия данной системы генов достаточно хорошо изучена у мягкой пшеницы [1]. Можно предположить, что у тритикале она также играет основную роль в генетическом контроле типа и скорости развития растений и, следовательно, в установлении их продуктивности и адаптации. В связи с этим исследования системы генов Vrn данной культуры, молекулярно-генетических основ их экспрессии, а также идентификация молекулярных маркеров для генов, влияющих на тип развития, являются актуальными и представляют особый интерес для использования в адаптивной селекции. Однако для проведения такого рода изысканий у тритикале не было соответствующего экспериментального материала с известными системами генов Vrn. В настоящее время нами созданы наборы линий, маркированные определенными системами генов Vrn, пригодные для изучения особенностей их экспрессии в генотипе тритикале. Данные линии были получены на основе почти изогенных по системе генов Vrn линий мягкой пшеницы и форм озимой и яровой ржи методом отдаленной гибридизации с применением эмбриокультуры [2]. Осуществляемая нами программа синтеза неизбежно связана с проведением цитологического анализа семенного потомства и отбором цитологически стабильных октоплоидных (2n = 56) и гексаплоидных (2n = 42) генотипов в более поздних поколениях (F4-F5). Для контроля стабильности нами проанализировано 190 культивируемых линий разных гибридных комбинаций F4.
У большинства изученных линий число хромосом в клетках было стабильным (42 или 56), причем гексаплоидных линий в каждой проанализированной комбинации было значительно больше, чем октоплоидных. Кроме того, обнаружено некоторое количество линий с 41 или 43—54 хромосомами [3]. Окто- и гексаплоидные тритикале различаются по ряду морфологических признаков: форме, количеству колосков, плотности и озерненности колоса, легкости обмолота зерна, наличию и длине остей, ломкости колосового стержня, опушенности колоса, размеру и форме колосковой и цветочной чешуй, что позволяет в некоторой степени идентифицировать их визуально в поле (рис. 1).
В ходе многолетних опытов по изучению экспрессии доминантных генов Vrn, определяющих яровой тип и скорость развития, выявлен ингибирующий эффект генетической среды тритикале. Нами было показано, что степень проявления генетических эффектов генов Vrn у тритикале обусловлена их спецификой: доминантные гены Vrn 1 или Vrn 1 Vrn 2, отвечающие за ранние сроки колошения пшеницы, ингибируются в большей степени новой генетической средой, чем гены Vrn 2 и Vrn 3, ответственные за более позднее колошение. Задержка колошения в первом случае в зависимости от комбинации скрещивания составила 21—11 дней, во втором — 16—6 [2].
Генетическая среда генотипа озимой ржи, участвовавшей в синтезе пшенично-ржаных амфидиплоидов, приводит к более сильному ингибированию эффекта доминантных генов Vrn, чем генетическая среда яровой ржи. В большинстве случаев позже выколашивались линии тритикале, где в качестве отцовского компонента скрещивания использовали озимую рожь [2].
В пределах отдельных комбинаций скрещивания в большинстве случаев октоплоидные линии выколашивались позже гексаплоидных, что свидетельствует о воздействии уровня плоидности на проявление анализируемых генов Vrn.
Было показано также, что хотя основной эффект на скорость колошения растений пшеницы и тритикале оказывает система генов Vrn, система Ppd (чувствительности к фотопериоду) в некоторых случаях также имеет существенное влияние. В дальнейших исследованиях выявлено, что в отдельных комбинациях у гексаплоидных линий тритикале наблюдалась значительная изменчивость числа дней до колошения, которая могла быть обусловлена разным хромосомным составом геномов этих линий. Был получен ряд скороспелых гексаплоидных линий, которые выколашивались раньше или в одни сроки с родительскими формами пшеницы, что особенно важно в связи с решением проблемы адаптации по срокам созревания данной культуры в условиях Беларуси.
Молекулярно-генетическое изучение линий тритикале с Vrn генами
В процессе селекции тритикале происходит стабилизация двух чужеродных геномов пшеницы и ржи, что сопровождается изменением ряда признаков, в том числе времени цветения и созревания. Остается неясным, связано это с влиянием хромосом ржи или вызвано рекомбинациями и транслокациями пшеничного и ржаного геномов. Для выяснения причин изменения продолжительности периода всходы-колошение у окто- и гексаплоидных тритикале совместно с Институтом цитологии и генетики СО РАН была изучена молекулярно-генетическая основа изменения экспрессии генов Vrn у этих форм. Наряду с другими изысканиями по реорганизации ядерного и цитоплазматического геномов при создании новых форм злаков методами биотехнологии эта работа была удостоена премии им. академика В.А. Коптюга.
В рамках проекта проведен молекулярно-генетический анализ коллекции линий тритикале с известными генами Vrn и Ppd, различающихся по сроку колошения. Исследования выполнены с использованием хромосом специфичных микросателлитных маркеров согласно методике [4], которую, как показывает практика, можно применять для сравнительного анализа разных видов злаков [5]. Для изучения геномного состава гексаплоидных тритикале было взято 156 микросателлитных маркеров Xgwm и Xgdm, картированных в геноме мягкой пшеницы T. aestivum, и 8 маркеров Xrms с известной локализацией в геноме ржи Secale cereale. С целью доказательства наличия пшеничных A, B и D хромосом было использовано от 4 до 17 микросателлитных маркеров на каждую хромосому. По наличию либо отсутствию фрагмента амплификации соответствующей длины, характерной для определенного маркера, делали вывод о присутствии в геноме хромосомы или ее фрагмента, на котором картирован данный маркер.
Сравнение спектров амплификации пшеничных микросателлитных маркеров у линий тритикале и их родительских форм позволило установить присутствие A и В хромосом мягкой пшеницы у всех линий тритикале (табл. 1).
Доказательство наличия хромосом ржи у гексаплоидных линий тритикале проводилось с помощью микросателлитных маркеров, картированных на ржаных хромосомах. Все ржаные маркеры амплифицировали фрагменты как у тритикале, так и у ржаных родителей, при этом у пшеничных амплификация отсутствовала. Данные, полученные с использованием ржаных маркеров, свидетельствовали о том, что все гексаплоидные линии содержат гомеологические хромосомы ржи в полном составе. Однако наличие амплификации ряда маркеров генома D у трех линий 49(10), 9(9) и 6(1) позволило предположить, что в процессе их образования могли происходить рекомбинации между ржаными и пшеничными хромосомами. Был проведен анализ линий тритикале методом геномной in situ гибридизации (GISH), в результате выяснено, что все исследованные линии являются гексаплоидными и несут по 14 хромосом ржи; транслокаций и рекомбинаций между пшеничными и ржаными хромосомами не обнаружено (рис. 2).
Таким образом, молекулярный анализ и гибридизация in situ показали наличие А и В геномов пшеницы, генома ржи и отсутствие пшенично-ржаных транслокаций, что дает основание предположить, что амплификация маркеров генома D связана с интрогрессией генома D в гомеологические хромосомы пшеницы. Следовательно, увеличение периода колошения изученных линий тритикале по сравнению с родительскими сортами пшеницы связано не с наличием пшенично-ржаных транслокаций в районах локализации генов Vrn, а вызваны влиянием хромосом ржи на проявление генов Vrn пшеницы вследствие изменения геномного состава тритикале (табл. 1). Полученные результаты служат основанием для объяснения экспрессии Vrn и Ppd генов при селекции на скороспелость у данной культуры.
Интрогрессия эгилопса в геном тритикале
В последние годы начаты работы по интрогрессии чужеродного генетического материала в геном культивируемых сортов тритикале с целью улучшения их хлебопекарных свойств, повышения устойчивости к болезням и другим неблагоприятным факторам. Активно обсуждается возможность потенциала рода Aegilops L. для расширения и улучшения генофонда зерновых [6, 7]. Важным этапом исследований в этом направлении является разработка наиболее оптимальных методов введения чужеродной информации в его геном. По нашему мнению, для этого наиболее приемлемо применить в скрещиваниях разнообразные формы пшеницы, несущие чужеродные хромосомы, их фрагменты или отдельные гены, или даже целые геномы. Нами предложен и экспериментально проверен новый способ расширения и улучшения генофонда посредством интрогрессии генетического материала Aegilops L. в геном гексаплоидных тритикале. Впервые в качестве генетического мостика при переносе чужеродного материала эгилопса использовали геномно-замещенные формы пшеницы Авролата (AABBUU), Аврозис (AABBSlSl) и Авротика (AABBMtMt), у которых геном D мягкой пщеницы Аврора замещен соответственно на геномы Ae. umbellulata, Ae. sharonensis и Ae. mutica [8]. Среди признаков геномно-замещенных форм, определяющих их значение для селекции, можно отметить устойчивость к различным видам ржавчины, мучнистой росе, а также повышенное содержание белка и выполненную по всей длине соломину. Данные формы являются более удобным объектом для переноса генетического материала Aegilops L. в тритикале, так как в этом случае включение чужеродного материала в геном гексаплоидных культур происходит с большей вероятностью, чем при скрещивании непосредственно с дикими видами.
Гибридные зерновки от скрещивания гексаплоидных тритикале с геномно-замещенными формами пшеницы получены по 17 комбинациям. При отдаленной гибридизации кроме низкой завязываемости гибридных зерновок часто наблюдается их полная невсхожесть. Однако в наших опытах всхожесть зерновок в большин¬стве комбинаций была сравнительно высока благодаря применению в качестве источника чужеродного генетического материала геномно-замещенных форм пшеницы (табл. 2).
Свидетельством присутствия генетического материала Aegilops в геноме гибридов тритикале F1 служат данные морфологического и биохимического анализов. Они показали, что окраска колосковой чешуи зрелого колоса у гибридов F1 варьировала от красной (Альмо Ч Авротика, Уго Ч Авротика, Модуль Ч Авротика, Уго Ч Аврозис) до темно-коричневой (Альмо Ч Авролата, Уго Ч Авролата, Модуль Ч Авролата), что свидетельствует о передаче этого признака от геномно-замещенных форм пшеницы. Согласно данным М.З. Антонюка и Т.В. Терновской, изучивших использованные нами формы Авролата, Аврозис и Авротика в сравнении с сортом Аврора (донором компонента ААВВ геномно-замещенных форм), коричневая окраска колосковой чешуи у названных форм — доказательство интрогрессии хромосом эгилопса первой гомеологичной группы [9]. Таким образом, коричневая окраска колосковой чешуи у анализируемых гибридных растений первого и последующих поколений может быть использована как маркерный признак генетического материала эгилопса первой группы гомеологичных хромосом.
Форма колоса у гибридов тритикале F1 подобна таковой геномно-замещенных форм. Колос, как правило, узкий, с удлиненной колосковой чешуей, которая несколько шире, чем у отцовской формы. Эти чешуи плотно облегают зерновку, гладкие, без опушения, воскового налета и вдавленности у основания. Это позволяет предположить присутствие хромосом эгилопсов (Ae. umbellulata, Ae. sharonensis и Ae. mutica) из второй гомеологичной группы, так как, по литературным данным, сочетание трех признаков — отсутствие вдавленности, воскового налета и жесткость чешуи — является маркером второй гомеологичной группы хромосом эгилопса. По данным ряда авторов, ломкость зрелого колоса геномно-замещенных форм пшеницы обусловлена присутствием генетического материала эгилопсов из третьей гомеологичной группы хромо-
сом [9]. Для гибридов первого поколения большинства комбинаций скрещивания, полученных нами, также отмечена ломкость колоскового стержня, в результате чего при созревании колос распадается на отдельные колоски, что позволяет предположить наличие генетического материала эгилопса из третьей гомеологичной группы хромосом.
Кроме морфологических маркеров самыми пригодными по своей доступности и часто употребляемыми для контроля за включением желаемых генетических систем — геномов, хромосом или их локусов — в создаваемые сорта и гибриды являются биохимические маркеры. Электрофоретические спектры глиадина, как и многих других белков, генотипичны: они не зависят от года репродукции и условий выращивания растений. Поэтому наряду с морфологическим анализом был проведен биохимический анализ глиадинов для шести гибридных комбинаций F1 и их родительских форм.
Установлено, что спектры глиадинов анализированных гибридов F1 включают компоненты обеих родительских форм, в том числе и компоненты, являющиеся маркерами генетического материала эгилопса первой и шестой гомеологичных групп хромосом.
Таким образом, морфологический и биохимический анализ гибридного материала F1 и их родительских форм позволили выявить в геноме гексаплоидного тритикале интрогрессию генетического материала Aegilops первой, второй, третьей и шестой групп гомеологичных хромосом. Полученные результаты доказывают возможность использования геномно-замещенных форм пшеницы, у которых геном D сорта Аврора замещен на геномы диплоидных видов рода Aegilops L., для переноса чужеродного генетического материала в геном тритикале с целью создания ее новых форм, представляющих интерес для генетико-селекционных исследований.
Исследования в области генетики зерновых культур, ориентированной на практическую селекцию, предполагает изучение содержания белка в зерне как одного из важнейших показателей его качества.
С этой целью нами были выделены из гибридных комбинаций F5 (Мально Ч Авролата, Альмо Ч Авролата, Альмо Ч Аврозис, Модуль Ч Аврозис) 4 лучшие, морфологически стабильные линии с маркерными признаками эгилопса. Выяснено, что использование в качестве отцовского компонента скрещивания геномно-замещенных форм пшеницы, обладающих высоким содержанием белка (18,59—19,36%), позволило повысить таковое у гибридов. Установлено, что величина данного показателя в гибридном материале варьировалась от 13,3 до 17,7% и превышала значения у материнских форм тритикале (рис. 3).
В результате проведенной работы выделены ценные гибридные генотипы, которые в сопоставлении с исходными сортами обладают повышенным содержанием белка. В Белорусскую государственную сельскохозяйственную академию и НПЦ НАН Беларуси по земледелию переданы 4 формы тритикале с интрогрессией генетического материала эгилопса.

Исследования выполнены при финансовой поддержке БРФФИ (№Б08Р-059)
и РФФИ (грант №08-04-90036-Бел_а).

Комментарии

промышленное использование тритикале

ищу партеров, занимающихся разработкой и постановкой на производство хлебобулочных и мучных кондитерских изделий из муки тритикале