Цитогенетика крови при сердечно-сосудистых патологиях

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) стали самыми распространенными и опасными патологиями во многих странах мира. Обусловленные нарушениями нормального функционирования сердца и сосудов, они являются одной из основных причин нетрудоспособности, инвалидности и преждевременной смертности населения. Патологии сердечно-сосудистой системы (ССС) – большая проблема современной медицины [1–5].
По подсчетам ВОЗ, к 2030 г. от них, главным образом от болезней сердца и инсульта, умрет около 23,6 млн человек [6].
В Республике Беларусь в течение последних лет отмечается рост ССЗ. Так, с 2000 по 2011 г. частота данных заболеваний возросла почти в два раза, причем лидируют артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца (ИБС) и цереброваскулярные расстройства. Также растут смертность и инвалидность от болезней системы кровообращения [7]. В связи с этим в настоящее время весьма актуальна разработка новых методов профилактики, диагностики и лечения патологий ССС.
Целью данной работы стало изучение цитогенетических показателей периферической крови людей, страдающих сердечно­сосудистыми патологиями. В ходе ее выполнения на основе материала, предоставленного Республиканским научно­практическим центром «Кардиология», исследовалось содержание стволовых клеток с фенотипами CD117+, CD34+, CD117+/CD34+ в крови пациентов 12–18 лет обоего пола с желудочковыми нарушениями ритма сердца. В контрольную группу были включены здоровые дети.
Исследование велось с помощью проточного цитофлуориметра Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Выделение «гейтов» клеток для анализа осуществляли по параметрам прямого и углового светорассеяния (FSC vs SSC), в смешанных линейно­логарифмических режимах (SSC vs FL1, FL2, FL3) или только с использованием параметров флуоресценции с логарифмическим усилением сигнала (log/log). В каждом из образцов проводили сбор не менее 10 тыс. событий. Применялись коммерческие моноклональные антитела (Beckman Coulter). Опыты проводились с одноцветными метками. Также были изучены молекулярно­биологические показатели крови детей, участвующих в эксперименте. Для этого использовался проточный цитофлуориметр Cytomics FC500 (Beckman Coulter). Исследовано количество клеток с признаками апоптоза и с микроядрами, а также число клеток в G0/G1, S, G2/M фазах клеточного цикла на основании гистограмм распределения ДНК.
Анализ содержания ДНК проводили в клетках, которые предварительно фиксировались в этаноле. Образцы клеток отмывали дважды фосфатно­солевым буфером (ФСБ), помещали в охлажденный этанол (70%) и хранили при –20 °С до момента проведения эксперимента. Затем их отмывали ФСБ, обрабатывали раствором РНК­азы (150 Ед/мл) и окрашивали раствором PI (пропидиум иодид, 50 мкг/мл) в течение 30 мин. при комнатной температуре. После этого образцы оценивались с использованием цитофлуориметрического анализа. Количество апоптотических клеток рассчитывали на основании измерения гиподиплоидной ДНК, окрашенной иодистым пропидием (50 мкг/мл). Регистрировали апоптотические клетки с содержанием ДНК менее 2n.
В ходе работы изучались молекулярно­биологические показатели (число клеток с признаками апоптоза и с микроядрами, а также количество клеток в G0/G1, S, G2/M фазах клеточного цикла) крови людей обоего пола в возрасте 44–80 лет с ИБС, которые в дальнейшем подвергались оперативным вмешательствам (аортокоронарное шунтирование, маммарно­коронарное шунтирование, пластика митрального клапана и др.). В контрольные группы были включены доноры без ССЗ из двух областей Беларуси – Минской (доноры 1) и Гомельской (доноры 2).
Полученные результаты обрабатывали при помощи пакета прикладных программ Excel и STATISTICA 6.0. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Для проверки распределений применялись статистические критерии Шапиро – Уилкса и Колмогорова – Смирнова. Статистическую достоверность различий между группами данных оценивали с помощью t­критерия Стьюдента, значимые различия в группах фиксировали при уровне p<0,05. В результате исследования числа стволовых клеток с поверхностными клеточными маркерами CD117+, CD34+ и CD117+/СD34+ в крови детей с желудочковыми нарушениями ритма сердца получены следующие результаты (табл. 1). Выявлено, что количество эндотелиальных прогениторных клеток у данных пациентов выше по сравнению со здоровыми людьми (p<0,05). Так, процент клеток с CD117+ у детей с патологией со стороны ССС был на уровне 1,17±0,14, в то время как у здоровых обследуемых данный показатель составил 0,73±0,13% (p<0,05). Число клеток с фенотипом CD34+ у людей с желудочковыми нарушениями ритма сердца было значительно выше по сравнению с контрольными показателями (2,02±0,34% и 1,20±0,32% соответственно). В результате проведения анализа числа клеток с CD117+/СD34+ в крови данных пациентов выявлено достоверное увеличение описываемого показателя по сравнению с контрольной группой людей. Так, количество клеток CD117+/СD34+ в группе детей с желудочковыми нарушениями ритма было 0,96±0,15%, а в контрольной группе процент данных клеток равнялся 0,49±0,12 (p<0,05).
В этой связи можно сделать вывод о том, что увеличение числа эндотелиальных прогениторных клеток в крови детей c желудочковыми нарушениями ритма сердца является результатом мобилизации стволовых клеток в ответ на развитие повреждений и нарушений работы ССС.
Результаты проведенного анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла, изменения доли клеток с признаками повреждения ДНК представлены в табл. 2. Выявлено, что число клеток с признаками апоптоза у детей с желудочковыми нарушениями ритма сердца составило 5,04±0,73%, а в контрольной группе равнялось 11,73±3,00% (p<0,05). Процент клеток с микроядрами у пациентов с CCЗ был 1,73±0,25, в то время как у здоровых людей – 6,46±0,93% (p<0,05). Таким образом, установлено, что число клеток с признаками повреждения ДНК у больных детей меньше по сравнению со здоровыми. Распределение клеток по фазам клеточного цикла у пациентов с желудочковыми нарушениями ритма соответствовало таковому у контрольной группы (табл. 2).
При исследовании молекулярно­биологических показателей крови пациентов, страдающих ИБС, установлена зависимость между количеством клеток с признаками повреждений генетического материала и степенью прогрессирования патологии (рис. 1–3). Выявлено, что у пациентов с заболеваниями сердца и сосудов доля апоптотических клеток и клеток с микроядрами достоверно ниже, чем у здоровых доноров из двух разных областей республики (p<0,05) (рис. 1).
При оценке состояния пациентов с ССЗ в зависимости от степени развития сердечной недостаточности (СН) по FC NYHA было установлено, что у людей с СН первой степени по FC NYHA уровень клеток с микроядрами и признаками апоптоза достоверно ниже по сравнению с пациентами двух других групп. Более низкий уровень клеток с повреждениями ДНК у пациентов с ССЗ по сравнению со здоровыми донорами, с одной стороны (рис. 1), и увеличение числа таких клеток в зависимости от степени развития СН по FC NYHA (рис. 2, 3), с другой, говорят о том, что у больных происходит быстрое и частое обновление пула клеток крови и его истощение, что в данном случае и приводит к формированию особого «клеточного фенотипа» у больных с ССЗ, который выражается не в меньшем уровне повреждения ДНК, а в меньшем числе клеток, проявляющих выбранные в данном исследовании молекулярно­биологические маркеры повреждения ДНК. Данное предположение подтверждается также тем, что после оперативного вмешательства происходит достоверное увеличение доли клеток с маркерами повреждения ДНК только в группе больных с СН первой степени по FC NYHA и недостоверное увеличение – во второй группе.
Таким образом, установлено, что у детей с нарушениями ритма сердца наблюдается значительное увеличение числа стволовых клеток с CD117+, CD34+ и CD117+/СD34+ в крови. Количество клеток с признаками апоптоза и микроядрами снижается у пациентов, страдающих заболеваниями ССС. У людей с ССЗ в условиях изменения процессов дифференцировки, деления и гибели клеток происходит формирование «клеточного фенотипа», который выражается в изменении соотношения клеток с различными молекулярно­биологическими маркерами. Следовательно, применение комплексного изучения молекулярно­генетических показателей весьма перспективно при оценке тяжести развития сердечно­сосудистых заболеваний и эффективности проводимого лечения.

Статья поступила в редакцию 14.08.2014 г.

Summary
We investigated the number of stem cells with CD117+, CD34+, CD117+/CD34+ and molecular-biological parameters in blood of people with cardiovascular diseases (flow cytometry). It is shown that the number of stem cells increases in blood of children suffering from heart rhythm disturbance. The number of cells with damage of DNA decreases in people with cardiovascular diseases. The complex investigation of molecular-biological parameters is perspective to diagnosis and estimation of treatment of cardiovascular diseases.

Литература
1. Литвинчук С. Глобальное бремя артериальной гипертензии. Мировая статистика // Medicine Review. 2009, №4. С. 6–11.
2. Finegold J. A. Mortality from ischaemic heart disease by country, region, and age: Statistic from World Health Organization and United Nationals / J. A. Finegold, P. Asaria, D. P. Francis // Int J Cardiol. 2013. V. 168, №2. P. 934–945.
3. Newcomer J. W. Antipsychotic medications: metabolic and cardiovascular risk. / J. W. Newcomer // J Clinical Psychiatry. 2007. V. 68, №4. P. 8–13.
4. Endogenous bioactive peptides as potential biomarkers for atherosclerotic coronary heart disease. / T. Watanabe [et al.] // Sensors. 2012. V. 12, №4. P. 4974–4985.
5. Nickens M. A. Cardiovascular disease in pregnancy / M. A. Nickens, R. C. Long, S. A. Geraci // South Med J. 2013. V. 106, №11. P. 624–630.
6. ВОЗ. Сердечно-сосудистые заболевания. 2012. Электронный ресурс: http://www.who.int./mediacentre/factsheets/fs317/ru/index/html.
7. 19 апреля – День профилактики болезней сердца. 2012. Электронный ресурс: www.28gp.by/index.php page=edz12_hd.