Получение лекарственных белков человека с использованием трансгенеза

Одним из главных достижений современной биотехнологии является производство рекомбинантных или генно-инженерных терапевтических белков человека в промышленных масштабах. В настоящее время в разных странах их выпускается более 120, из которых 100, пройдя клинические испытания, разрешены к использованию в Европейском Союзе и США. Генно-инженерные гормоны, ферменты, факторы роста тканей и системы свертывания крови, антитела, иммуномодуляторы, белки женского молока — это эффективные, но дорогостоящие и дефицитные лекарственные средства нового поколения.

Некоторые рекомбинантные белки человека традиционно синтезируют в клетках микроорганизмов, таких как дрожжи или бактерии. Так, например, производят интерфероны и генно-инженерный инсулин, наиболее качественный из получаемых в настоящее время промышленным способом. К сожалению, бактерии не способны синтезировать чужеродные белки в больших количествах, часто они формируют трудноразделимые агрегаты. Кроме того, у них отсутствует присущий только животным клеткам механизм посттрансляционных модификаций белков (гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, карбоксилирования) и некоторых других преобразований, необходимых для проявления биологической активности.
В определенной мере проблемы многотоннажного производства лекарственных белков пытаются решить с помощью клеточных биореакторов, в которых сейчас синтезируются различные антитела человека, эритропоэтин, фактор VII свертывающей системы крови человека и ряд других терапевтических средств. Однако высокая стоимость их строительства и поддержания функционирования не позволяет широко использовать данную систему. Кроме того, изолированные клетки животных часто мутируют, и это вызывает необходимость остановки агрегата. По¬этому рост потребности в качественных и недорогих лекарственных препаратах на основе белков человека привел к новым методам их производства — созданию трансгенных животных или животных-продуцентов терапевтических протеинов. Это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген).
Традиционно проводимая в настоящее время селекционно-племенная работа в животноводстве с целью совершенствования продуктивных качеств животных базируется главным образом на мутационной, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций, и занимает очень длительный промежуток времени (20—50 лет). Развитие же молекулярной биологии, генетики и генной инженерии сделало возможным быструю направленную модификацию животных посредством внедрения в их геном новых генов (трансгенез).
Получение трансгенных особей, которых можно использовать в качестве продуцентов для производства лекарственных белков человека, является крупнейшим шагом в становлении фармацевтической промышленности нового типа. Это позволит существенно повысить качество и объемы выпуска таких препаратов, что, в свою очередь, сделает их доступными широкому кругу пациентов.
Данный метод обладает неоспоримыми преимуществами, поскольку молочные железы сельскохозяйственных животных — природные фабрики белка. Состав молока менее сложен, чем, например, крови — традиционного источника лечебных белков, что в значительной мере упрощает процесс их выделения и очистки. Молочные железы изолированы от циркуляционной системы, и это делает невозможным попадание в молоко животных-продуцентов метаболически активных чужеродных белков. В отличие от крови человека оно не может служить источником контаминации (загрязнения) вирусом СПИДа или гепатита В. Кроме того, посттрансляционные модификации лекарственных белков, происходящие в молочных железах животных, аналогичны соответствующим модификациям в организме человека, что в полной мере обеспечивает их биологическую активность и стабильность.
Использование для получения лекарственных белков человека животных-продуцентов снимает множество вопросов. Это экологически чистое неэнергоемкое производство, дающее возможность контролировать объем выпускаемых препаратов в зависимости от требований рынка регулированием численности популяции. Что касается расходов на их выделение и очистку с целью обязательного получения 95—98% чистоты протеина, то они примерно одинаковы при применении любого из имеющихся подходов.
Генно-модифицированные бактерии и трансгенные животные являются носителями чужеродного гена (трансгена). На нем происходит синтез или сборка необходимого белка, затем данный протеин выделяется в клетку бактерии или околоклеточное пространство (при микробном синтезе) или молочную железу (в случае животного-продуцента). Далее белок адсорбируется из жидкости и очищается, а трансген остается в бактериальной клетке или организме животного. Таким образом, в чистом полученном продукте трансген отсутствует. Клетки-продуценты или животные-продуценты — лишь промежуточное звено от гена к белку.
Проведенные в различных странах маркетинговые исследования однозначно свидетельствуют о том, что технология получения лекарственных белков человека с помощью животных-продуцентов по сравнению с другими биотехнологическими системами обеспечивает наиболее высокое качество и наименьшую себестоимость продукции. Сегодня работы по созданию производств таких препаратов терапевтического и диагностического направления интенсивно ведут более 20 биотехнологических и фармацевтических корпораций мира. При этом в качестве животного-продуцента лекарственных белков человека выбираются козы. Они неприхотливы в содержании, устойчивы к инфекционной патологии, имеют короткий период беременности (5 месяцев), за время лактации способны давать до 1 тыс. л высококачественного молока.
Лидирующее положение в использовании коз как животных-продуцентов сегодня занимает биотехнологическая компания GTC Biotherapeutics (США), у которой на разных стадиях разработки находится 25 лекарственных белков человека, получаемых в их молоке. Один из них, антитромбин III (коммерческое название — ATryn), после проведенных клинических испытаний разрешен к применению при операциях на сердце, сосудах и у ожоговых больных. На 15-летние научные исследования и создание технологии производства ATryn фирма GTC затратила около 50 млн долл. США. Значительные средства пошли на приобретение в Новой Зеландии здоровых коз. Теперь их содержат в специальном загоне площадью около 75 га, расположенном на участке в 120 га. Из популяции численностью более 300 голов отобрано всего 30 особей, которые и составляют основную промышленную популяцию животных-продуцентов препарата ATryn, еще 1200 обычных племенных коз предназначены для скрещивания. Активный белок человека извлекается из молока животных, трансгенных по гену человека, отвечающему за выработку антитромбина III. От одной особи можно получить столько же данного вещества, сколько из 90 тыс. донорских доз крови. Несмотря на ограниченный контингент больных, нуждающихся в ATryn (этот белок отсутствует у примерно одного из 3—5 тыс. человек), ежегодная планируемая прибыль компании GTC только по этому препарату может составить более 700 млн долл. Произведенные фирмой затраты на научные исследования начали окупаться уже в 2004 г., когда лицензию на производство противосвертывающего лекарства приобрели в ФРГ (17 млн долл. США) и Японии (8 млн долл.).
Новым достижением в области трансгенных технологий стали успехи американской компании PharmAthene, недавно получившей трансгенных коз-продуцентов, молоко которых содержит бутирилхолинэстеразу, являющуюся антидотом боевых отравляющих веществ из группы фосфорорганических соединений, в том числе зарина и VX-газов. Этот фермент может использоваться для лечения острых отравлений и как средство профилактики в случае угрозы применения химического оружия. Один литр молока содержит 2—3 грамма такого вещества. На данный момент общий вес наработанной бутирилхолинэстеразы достиг 15 кг. Финансирование проекта осуществлялось Министерством обороны США, из бюджета военного ведомства было выделено 213 млн долл.
В программе Союзного государства «БелРосТрансген» в качестве первого разрабатываемого лекарственного белка был определен лактоферрин человека. Это белок женского молока, обладающий сильным детоксицирующим, антибактериальным и противовоспалительным действием. Его применение как пищевой добавки позволит в 10 раз снизить заболеваемость гастроэнтеритами у грудных детей-искусственников. Данный препарат может быть выделен и использован с цельным молоком в качестве лечебного средства, диетического питания, для приготовления различных пищевых добавок. Проведенные программные исследования доказали, что лактоферрин человека, получаемый в молоке лабораторных животных-продуцентов, оказался идентичным лактоферрину женского молока как по физико-химическим свойствам, так и по биологической активности. Здоровье мышей-продуцентов, изученное во многих поколениях, показало, что у них не нарушается функция воспроизведения, а при микроскопии тканей и внутренних органов каких-либо патологических изменений не возникает.
На основе лактоферрина человека могут быть созданы высокоэффективные и биологически безопасные препараты нового поколения. В отличие от антибиотиков, к которым происходит «привыкание» микроорганизмов, к бактерицидному лекарственному белку лактоферрину эффективных генетических механизмов защиты у большинства микробов нет, поскольку его действие в основном сводится к лишению их источников жизнеобеспечения. Бактериостатическая и бактериолитическая активность этого вещества связана с тем, что данный белок отнимает у бактерий железо, что приводит к угнетению роста микрофлоры. Лактоферрин прочно фиксируется на поверхности микроорганизма, нарушая проницаемость мембраны патогена и тем самым снижая его резистентность (устойчивость). Он подвержен частичному протеолизу (ферментативному расщеплению), в результате чего образуется ряд пептидов (лактоферрицинов), обладающих повышенной избирательной антибактериальной активностью по отношению к определенным микроорганизмам.
Таким образом, впервые в истории фарм¬индустрии Российской Федерации и Республики Беларусь появилась реальная возможность создания оригинальной линии высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств нового типа, а также пищевых продуктов, содержащих лактоферрин человека. Научные разработки в этом направлении, выполненные совместно российскими и белорусскими учеными, на сегодняшний день опережают мировые достижения.