Природный биополимер хитин называют продуктом XXI века. Основной источник этого волокна – панцирные ракообразные, насекомые и грибы. Клеточная стенка гриба Aspergillus niger L., являющегося продуцентом лимонной кислоты и отходом ее производства, содержит 20–25% хитина. Выделение биополимера из этого вида сырья не требует затрат на его добычу, одновременно достигается утилизация отработанного материала. Однако хитин грибов образует трудно разрушаемые комплексы с -глюканами, поэтому чистое волокно выделить сложно и затратно. В результате при обработке биомассы грибов выделяют не хитин, а хитин-глюкановый комплекс (ХГК).
Известно более 70 напра­влений практического применения хитина и его производных (в частности, хитозана), основные – биотехнология, медицина, пищевая, косметическая промышленность, сельское хозяйство и ветеринария. ХГК способен выводить ионы тяжелых металлов и радионуклиды, адсорбировать значительное количество желчных кислот, токсины и электролиты, положительно воздействует на микрофлору пищеварительного тракта человека, снижает риск возникновения таких заболеваний, как рак толстой кишки, ожирение, содействует деинтоксикации организма [1]. С целью получения данного комплекса и дальнейшего исследования его свойств в наших опытах использовался материал клеточной стенки гриба Aspergillus niger L.
Макросъемку проводили фотоаппаратом SONY NEX 5N. При изучении морфологической структуры и химического состава применяли сканирующий микроскоп JSM 5610 LV с системой электронно-зондового энергодисперсного химического анализа EDX JED 2201 (JEOL, Япония). Изображения получали при ускоряющем напряжении 20 kV на детекторе обратно-отраженных электронов в режиме низкого вакуума для снятия с образца без нанесения покрытия.
Фазовая структура исследована методом рентгенографии. Образец ХГК для записи рентгенодифрактограмы готовили в виде монолитной таблетки плоскоцилиндрической формы с гладкой поверхностью. Дифракционные кривые записывали на дифрактометре HZG 4A (Carl Zeiss, Германия) с использованием медного (CuK ) излучения, фильтрованного никелем. Кривая снималась в шаговом режиме дискретного сканирования, который, в отличие от непрерывного, обеспечивает высокую информативность и точность метода рентгенофазового анализа: возможность прецизионного определения положения дифракционных рефлексов. Рентгенограмму исследуемого образца описывали в режиме «на отражение».
Хитин (C8H13NO5)n (фр. chitine, от др. – греч. хитон – одежда, кожа, оболочка) – природное соединение из группы азотсодержащих полисахаридов [2]. Химическое название – поли-N-ацетил-D-глюкозо 2-амин, полимер из остатков N-ацетилглюкозамина, скрепленных между собой -(1,4)-гликозидными связями.
Бета 1,3/1,6-глюканы являются природными углеводами, находящимися в стенках клеток дрожжей, бактерий и грибов [3] (в составе двух последних также присутствует основной компонент экзоскелета (кутикулы) членистоногих и ряда других беспозвоночных). В грибах они представлены в виде комплекса – хитин-глюкана, который практически не усваивается в организме человека. Их молекула состоит из длинной основной цепи молекул глюкозы, соединенных 1,3-связями, и боковых, сообщающихся таким же образом. Боковые цепи скреплены с основной 1,6-связями.
Самое важное свойство -глюкана – принадлежность к иммунным активаторам [3]. Он повышает неспеци­фический и специфический иммунитет путем определения и стимулирования макрофагов, Т-киллеров, Т-хелперов и НК-клеток; скорость созревания иммунокомпетентных клеток и, что очень существенно, увеличивает их жизненный срок.
Клеточные мембраны макрофагов обладают специ­фическими рецепторами для -глюкана [3, 4]. Когда он прикрепляется к рецептору, макрофаг «оживляется», идентифицирует вторгающиеся патогены и удаляет их из организма. Стимулируется производство цитокинов – интерферона и интерлейкинов – для ускорения защиты. Кроме того, -глюкан может приводить в движение выпуск фактора некроза опухоли, сильнодействующий защитный белок и супер­оксид, побуждающий кровяные клетки человека, такие как моноциты, вести химическую войну с агрессорами.
Весьма актуален сегодня поиск эффективных энтеросорбентов, способных снизить аккумуляцию вредных веществ в организме и при этом оказывающих на него мягкое биологическое воздействие. Такими особенностями обладают сорбенты из природных продуктов, среди которых особое место занимает полисахарид хитин, благодаря его уникальным свойствам – биосовместимости, биодеградируемости, нетоксичности и бактерицидности [5].
В России проводятся фундаментальные исследования в области хитина и хитозана. Так, найдены новые аспекты практического применения этих биополимеров. Получены результаты по взаимодействию хитозана с белками и нуклеиновыми кислотами, противовирусному и противоопухолевому эффекту его производных, созданию микро- и наночастиц различного строения, зарегистрировано большое разнообразие хитозансодержащих препаратов (для защиты растений, ветеринарные, косметические средства, пищевые добавки, БАДы) [6].
Хитин и хитозан обладают высокой физиологической активностью. Первый является исходным сырьем для получения D-глюкозамина для целей медицины. Хитоолигосахариды обнаруживают противоопухолевые и иммуностимулирующие свойства, усиливают рост растений, ингибируют размножение паразитов. Хитин используют также для создания апирогенных хирургических нитей, контактных линз, искусственной кожи [7]. В медучреждениях с помощью хитина и его производ­ных заживляют ожоги, раны и язвы (время регенерации сокращается на 75%) [8].
Благодаря способности растворяться в водных средах и органических растворителях более широкое применение нашли многочисленные модификации хитина, такие как хитозан, карбоксиметилхитозан и др. Хитозан используют во врачебной практике (например, для лечения болезней желудка; хитозановые мембраны есть в аппаратах типа «искусственная почка») [9], в пищевой технологии в качестве загустителя и структурообразователя при производстве муссов, желе, соков и т. д. Его также можно применять для снижения кислотности и осветления фруктовых соков. При добавлении хитозана в молочные продукты срок их хранения увеличивается. Хитозан в комплексе с белками используется в качестве субстрата для микроорганизмов, например дрожжей [8].
Возможно применение хитозана при извлечении нуклидов из сточных вод ядерных реакторов и других жидкостей, зараженных радио­активными веществами. Даже в условии радиоактивного облучения, приводящего к деструкции многих биополимеров, он сохраняет свою структуру и сорбирующие свойства и способен очищать сточные воды от различных анионов 7].
Один из путей получения хитина и его модификаций – химическая обработка хитинсодержащего сырья, подразумевающая соблюдение повышенных мер предосторожности при хранении и работе с концентрированными кислотами и щелочами. Общая схема выделения хитина химическим способом заключается в измельчении сырья, дальнейшем его депротеинировании, промывке и деминерализации, а также деацетилировании – для получения хитозана. Деминерализация обычно осуществляется соляной, муравьиной, азотной или сернистой кислотами, депротеинирование – щелочами, например гидроксидом натрия. Порядок проведения деминерализации и депротеинирования оказывает большое влияние на качество извлеченного хитина и его производ­ных. Так, при работе по схеме «депротеинирование – деминерализация» кинематическая вязкость хитина значительно ниже, чем при его получении по обратной схеме.
В зависимости от требований к конечному продукту выбирают различные методы обработки химреагентами. Для тонкого панциря криля, гаммаруса или насекомых достаточно однократного экстрагирования щелочью. При необходимости получения хитина, полностью свободного от белка, применяют двукратное выщелачивание. После однократной обработки кислотой содержание минеральных веществ обычно не превышает 1–3%.
На начальном этапе наших исследований выделение ХГК проводили химическим способом по методике [10]. С целью глубокого удаления разнообразных веществ из ХГК навеска биомассы Aspergillus niger L., отхода производства лимонной кислоты на Скидельском сахарном комбинате, последовательно обрабатывалась углекислым натрием и соляной кислотой в автоклаве.
Первая стадия обработки: химреагент – углекислый натрий концентрацией 9%, гидромодуль 1:5, время обработки – 0,25 ч, температура – 98 ?С. Вторая стадия: реагент – углекислый натрий концентрацией 9%, гидромодуль 1:4, время – 0,25 ч, температура – 98 ?С. Третья стадия: реагент – соляная кислота концентрацией 7,1%, гидромодуль 1:5, время – 2 ч, температура – 20 С.
После каждой стадии смесь разделяли на отработанный раствор и полуфабрикат. Полученный полуфабрикат промывали дистиллированной водой (температурой 98 С) до нейтральной реакции. Применение очищенной воды в данном процессе позволяет снизить содержание минеральных веществ в конечном продукте, а высокая температура необходима для эффективного вымывания химических соединений и побочных продуктов реакции из выделяемого хитин-глюканового комплекса [10]. Затем полученный ХГК высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу при 50 ?С.
И хотя химическая технология широко изучена и освоена, все же она не вписывается в схему безотходного производства из-за наличия ряда очевидных недостатков. Длительное нахождение хитинсодержащего сырья в агрессивных средах (в растворе щелочи и кислот, особенно при высоких температурах и продолжительном воздействии) приводит к деструкции и частичному деацетилированию хитина, снижает вязкость его растворов. В итоге качество готового продукта и сопутствующих компонентов (белков, липидов) ухудшается. Белково-минеральная составляющая в связи с переводом в деструктурированные солевые формы лишается своей биологической ценности. Однако выделить хитин, например, из панциря крабов можно только кислотно-­щелочным способом.
Новая, альтернативная технология получения хитина была разработана в институте «Гипрорыбфлот» (Санкт-Петербург, Россия). В ее основе лежит замена традиционно используемых для этих целей химреагентов (кислот и щелочей) на электрохимически активированные растворы [5]. Электрохимический метод выделения ХГК заключается в обработке хитинсодержащего сырья в водных растворах электролитов под действием постоянного электрического тока. При этом депротеинирование проводят в катодной камере, а процесс деминерализации – в анодной камере электролизера. Выделяют ХГК по данной методике из биомассы Aspergillus niger L.
По своему химическому строению хитин весьма близок к целлюлозе: его молекулы обладают большой жесткостью и склонны к формированию надмолекулярных, или фибриллярных, структур. В них молекулы хитина скреплены водородными связями и располагаются почти параллельными пучками, составляя регулярные в трех измерениях конфигурации, что характерно для кристаллов. Известно несколько типов таких кристаллических образований ( -, -, -хитины), которые различаются степенью упорядоченности и взаимной ориентацией полимерных молекул [1].
Поскольку ХГК планируется использовать в качестве сорбента в пищевой промышленности, возникает необходимость подбора и оптимизации методики выделения данного комплекса с учетом особенностей производства лимонной кислоты. Электрохимический метод обеспечивает щадящие условия в ходе технологического процесса и получение продукта, обладающего высокими сорбционными свойствами и биологической активностью.
Для исследований морфологической структуры и химического состава ХГК выделение проводили по методике [11]. Биомассу Aspergillus niger L. – отход производства лимонной кислоты на Скидельском сахарном комбинате – смешивали с предварительно подготовленным раствором католита (водный раствор хлорида натрия), нагревали полученную смесь, отделяли твердую фракцию – хитиновый полуфабрикат и производили его последующую электрохимическую обработку (при 60–80 С в 0,1–5%-ном водном растворе электролита при соотношении «хитиновый полуфабрикат – электролит» в диапазоне 1:3–1:28 и значении плотности тока 200–670 А/м2 до достижения рН среды не менее 11,5–12,5) вместе в катодной камере электролизера.
Данный способ был реализован в лабораторных условиях с помощью двухкамерного электролизера, состоящего из катодного и анодного пространств. Смесь разделяли посредством капронового фильтра на белковый раствор и хитиновый сорбент. Последний промывали водой до нейтральной реакции и сушили в сушильном шкафу до постоянного веса. Результаты исследования представлены на рис. 1–6 и в таблице. На рис. 1 показано, как выглядит полученный нами ХГК. Хитин-глюкановый комплекс имеет вид мелких чешуек неправильной формы, коричневого цвета. Размер частиц зависит от степени измельчения.
Анализируя сканирующие электронные микрофотографии (рис. 2 и 4), можно отметить, что поверхность выделенного ХГК имеет неравномерную структуру. На ней присутствует большое количество разнообразных выпуклостей и вогнутостей, то есть какой-либо регулярности их формы и размеров не наблюдается. Необходимо обозначить и такой важный момент, как присутствие в хитин-глюкановом комплексе хорошо различимых белых образований, напоминающих кристаллы.
В итоге проведенного исследования нами изучено распределение по поверхности ХГК основных химических элементов – кислорода (О), натрия (Na), магния (Mg), алюминия (Al), кремния (Si), фосфора (Р), калия (К), кальция (Ca), а также общий его вид. Так, на рис. 2 представлена обычная сканирующая электронная микрофотография ХГК и размещение О, Na, Mg, Al и Si, а на рис. 3 – Р, К, Ca и общий вид рассредоточения всех выявленных составляющих (О, Na, Mg, Al, Si, P, K и Ca). На рис. 5 и в таблице приведены количественные характеристики обнаруженных в ХГК химических элементов.
Согласно исследованиям поверхности ХГК, все изученные элементы можно расположить в соответствии с их количеством в ряд по убыванию: О – 82,32%, Са – 10,44%, Аl – 2,66%, Mg – 2,2%, Si – 1,41% и Р – 0,97% (рис. 3 и табл.). При этом на поверхности комплекса не было отмечено натрия и калия. Наличие в ХГК кислорода и фосфора может указывать на органическую природу данного продукта.
При анализе выявленных на поверхности ХГК белых образований установлено, что они состоят из кальция (50,81%), кислорода (47,41%), натрия (1,21%), магния (0,34%), алюминия (0,18%) и фосфора (0,05%) (рис. 3 и табл.). Кремний и калий в них отсутствуют. Исходя из этого, можно сделать предположение, что такие кристаллические образования сформированы в основном кальцием и кислородом.
Исследование фазовой структуры ХГК (рис. 6) свидетельствует, что он обладает аморфно-кристаллическим строением. Хорошо различимые рефлексы при 9,2 , 12,6 , 19,2 и 26,2 указывают на наличие кристаллических участков. Рефлекс, зафиксированный на участке рентгентограмы от 27 до 30 , характерен для минеральной примеси (песка).
Таким образом, впервые в Республике Беларусь нами в лабораторных условиях получен новый вид биосовместимого сорбента – хитин-глюкановый комплекс, исследованы его структура и некоторые свойства. Актуальность работы определена необходимостью освоения отечественной сырьевой базы хитинсодержащих материалов и их целевого использования. Установлено, что перспективным источником ХГК, целесообразным с экономической и экологической точки зрения, является отход микробиологического синтеза лимонной кислоты – биомасса мицелиального гриба Aspergillus niger L. Клеточная стенка этого гриба содержит 20–25% хитина, выход которого из 1 кг сырья составляет 200–250 г. Выделены аналитические зависимости, а также научно обоснованные подходы по разработке технологии производства и последующего применения ХГК как биосорбента с высокими показателями активности.

Статья поступила в редакцию 07.12.2015 г.

Summary
The article presents the main results of the morphological studies, phase structure and chemical composition of chitin-glucan complex, isolated in the laboratory from a producer of citric acid and its production of waste biomass Aspergillus niger L. Isolation of chitin-glucan complex of this kind of raw material will provide a new type of biocompatible sorbent. Chitin is the second abundant biopolymer after cellulose, which is synthesized not only by an enormous number of living organisms such as shrimps and crabs, but also by fungal and yeasts cells. The structure of chitin is comparable to the polysaccharide cellulose, forming crystalline nanofibrils or whiskers. In terms of function, it may be compared to the protein keratin. Chitin has also proven useful for several medical and industrial purposes. We extracted chitin-glucan complex electrochemical method. It is a powder from dark brown to light beige. The particle size depends on the degree of grinding. We research that chitin is composed of the following elements: О2–82,32%, Са – 10,44%, Аl – 2,66%, Mg – 2,20%, Si – 1,41%, Р – 0,97%. Chitin-glucan complex has an amorphous-crystalline structure and is clearly distinguishable reflexes at 9,2 , 12,6 , 19,2 and 26,2 .

Литература
1. Скрябин К. Г. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / К. Г. Скрябин, Г. А. Вихорева, В. П. Варламов. – М., 2002.
2. Ловкис З. В. Качество и безопасность пищевых продуктов: учеб. пособие / З. В. Ловкис, И. М. Почицкая, И. В. Мельтисова, В. В. Литвяк. – Мн., 2010.
3. -глюкан (бета-глюкан) // http://megdu.ru/nuda/-glyukan-beta-glyukan – glyukan/main.html.
4. Бета 1,3/1,6-глюканы в качестве иммунных модуляторов // http://www.linnafauna.eu/publ/beta.pdf.
5. Маслова Г. В. Теория и практика получения хитина электрохимическим способом // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. – М., 2002. С. 24–43.
6. Варламов В. П. Зарождение хитинологии // РЫБПРОМ: технологии и оборудование для переработки водных биоресурсов. 2010, №2. С. 4–8.
7. Новиков В. Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы VII междунар. конф., Санкт-Петербург, 15–18 сентября 2003 г. – М., 2003. С. 38–42.
8. Knorr D. Functional properties of chitin and chitosan // Journal of Food Science. 1982. Т. 47, №2. P. 593–595.
9. Mima S. et al. Highly deacetylated chitosan and its properties // Journal of Applied Polymer Science. 1983. Т. 28, №6. P. 909–917.
10. Канарская З. А. Получение и свойства хитин-глюканового адсорбента из биомассы грибов: автореферат диссертации на соискание ученой степени к. т. н.: специальность 03.00.23; [Казан. гос. технол. ун-т]. – Казань, 2000.
11. Способ получения хитинового сорбента: пат. №2218822 С1 РФ, МПК7 A23 L 001/33, A23L001/056 / Е. Э. Куприна, И. Ю. Козлова; заявитель «Государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота «Гипрорыбфлот»; заявл. 05.06.01; опубл. 20.12.03.