Новый метод анализа бактериальной биопленки

Для большинства клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов экспериментально доказаны общие временные особенности образования биопленки [1, 2]. Так, различные виды планктонных бактерий адгезируются к?поверхности и?присоединяются друг к?другу в?течение нескольких минут; образуют прочно соединенные микроколонии за?2–4 ч; вырабатывают внеклеточные полисахариды?– основное вещество биопленки?– за?6–18 ч; формируют полноценные сообщества за?1–2–4 дня (в зависимости от?видов микробов и?условий роста); быстро восстанавливаются после механического разрушения до?зрелой биопленки в?течение 24–48 ч.
Поскольку экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) является основным барьерным фактором защиты бактерий, обусловливая их толерантность к?биоцидам (антибиотикам, антисептикам и?т.?д.) и?компонентам иммунной системы макроорганизма, временной промежуток от?6 до?24 ч?– наиболее важный предмет лабораторного анализа.
Мы провели оценку способности штаммов S. aureus (n=48), выделенных из?хронических ран (ХР) пациентов, к?формированию биопленки. Как известно, стафилококк является комменсалом и?обитателем кожных покровов, с?чем сопряжена его преобладающая роль в этио­логии раневой инфекции. Наличие множества факторов вирулентности также обуслов­ливает его значимость в?патогенезе инфекций ран. S. aureus имеет факторы адгезии, которые обеспечивают ему прикрепление к?различным белкам, в?частности фибриногену и?коллагену. Наличие эластин- и?фибронектинсвязывающих белков позволяет стафилококку легко колонизировать ткани раны, а?также глубоко проникать и?распространяться за?счет разрушающего действия мембранных токсинов. Внутриклеточные адгезивные белки способствуют присоединению бактерий друг к другу, что ускоряет формирование биопленки. S. aureus образует также ряд агентов защиты с?антифагоцитарной активностью, вызывающих прямое повреждение нейтрофилов, а?также вырабатывает факторы, гарантирующие его персистенцию. Высокая степень вирулентности содействует беспрепятственному генерированию стафилококком биопленки в?самые ранние сроки от?момента адгезии к?поврежденным тканям, а?также обусловливает его преобладание в?инициации инфекционного процесса [3]. В?предварительных испытаниях нами показано, что S. aureus?– доминирующий представитель (частота обнаружения до?45%) микрофлоры хронических ран [4].
На рис. 1 представлены результаты динамической оценки формирования биопленки штаммами S. aureus, выделенными из?ХР при первичном бактериологическом исследовании (на момент поступления пациентов в?стационар). При интерпретации полученных данных и?определении различных вариантов способности создавать биопленку (отсутствует, низкая, умеренная, выраженная) мы руководствовались прежде всего значениями оптической плотности (OD), измеренными для этанольных экстрактов Congo red спустя сутки инкубации. Основывались на?том, что образование бактериями ЭПМ, который окрашивается Congo red,?– ключевой момент, характеризующий биопленку и?ее патогенетическую роль в?развитии и?поддержании заболевания.
С учетом условий постановки реакции (размер лунки планшета и?количество питательной среды) мы считаем, что проведение измерений после 24-часовой инкубации оптимально для оценки сформированной биопленки. Через этот?же промежуток времени также анализируется, какой характер образования биомассы наблюдается при той или иной степени интенсивности развития микробного конгломерата. Для этого определяют оптическую плотность элюата генцианвиолет/этанол. Оценка результатов через 2, 4, 6, 18, 48 ч инкубации необходима для детального описания динамики накопления биомассы и?основного вещества.
Выявлено, что для штаммов S. aureus (n=48), выделенных из?ХР, в?70% случаев (n=33) характерна высокая склонность к?формированию микробных биопленок. При этом наблюдалось постепенное увеличение значений оптической плотности элюатов Congo red с?достижением максимума через 24 ч инкубации (p<0,05) и?снижением показателя спустя 48 ч исследования. Наиболее активная адгезия и?пролиферация бактерий происходили в?период между 2-м и?4-м часами инкубации (р=0,01), после чего биомасса оставалась стабильной?– значимые изменения OD экстракта генцианвиолета не?регистрировались (рис. 1Г). Показатели абсорбции элюата генцианвиолета были ниже значений для раствора Congo red с?4 до?48 ч (p<0,05). Это говорит о?том, что при высокой степени интенсивности развития бактерии гораздо активнее образуют защитный ЭПМ, чем накапливают клеточную массу.
В 15% случаев (n=7) штаммы S. aureus обладали умеренной способностью формировать биопленку. Как видно из?рис. 1В, при таком варианте накопление ЭПМ активнее всего происходило в?период между 6-м и?18-м часами инкубации (p<0,01), к?48-му часу оптическая плотность Congo red снижалась (р=0,015). К?6 часам исследования своего максимума достигали значения абсорбции экстракта генцианвиолета (p<0,05) с?последующим снижением к?48 часам (р=0,01), что характеризует динамику изменения биомассы как умеренную.
При слабой способности возбудителей инфекции к?биопленкообразованию (рис. 1Б) максимальные показатели OD элюата Congo red регистрировались только через 6 ч инкубации (p<0,01), а?к?18 и?24 часам, когда происходит непосредственное образование сформировавшегося микробного конгломерата, наблюдалось снижение величины абсорбции (p<0,05). Динамика накопления биомассы была схожей с?процессом накопления ЭПМ, однако величины оптической плотности экстракта генцианвиолета во?все сроки превышали показатели для Congo red (p<0,05).
При отсутствии способности анализируемых бактерий формировать биопленку (рис. 1А) динамика накопления ее матрикса также отсутствовала на?протяжении всего исследования: значения OD Congo red / этанол не?изменялись. Однако период с?4 до?18 ч отличался наиболее интенсивным образованием биомассы (p<0,01). Частота выделения S. aureus с?низкой формирующей активностью или ее отсутствием была одинаковой и?составляла 7,5% (n=4).
Следовательно, разные уровни способности микроорганизмов к?формированию биопленки характеризуются определенными особенностями динамики этого процесса: при выраженной активности они синтезируют защитный матрикс, а?при ее отсутствии?– интенсивно накапливают клеточную массу.
На следующем этапе мы рассмотрели возможность применения предложенного нами метода исследования образования бактериальной биопленки для оценки эффективности терапии. Для этого провели сравнительный анализ способности к?созданию микробных конгло­мератов у?S. aureus, выделенного до?и?после лечения больных с?ХР. Пациентов разделили на?две группы. В?протокол лечения группы 1 (n=35) включили аппаратные методы?– ультра­звуковой дебридмент (диссектором «Sonoca 185» (25 кГц), «S?ring», Германия) и?вакуум-терапию (аспиратором В 40А производства НПО «Висма-Планар», Беларусь). После подготовки раны выполнялось закрытие раневого дефекта путем аутодермопластики (АДП). В?предоперационном плане группы 2 (n=17) фигурировали только традиционные методы с?использованием повязок с?антисептическими препаратами (хлоргексидин, повидон-йод), мазями на?полиэтиленгликолевой основе. После консервативного лечения этим пациентам также осуществлялась АДП. У?представителей обеих групп интраоперационно перед АДП производился забор раневого отделяемого для микробиологического анализа.
Выявлено, что после аппаратной терапии изменилась частота обнаружения штаммов S. aureus, обладающих различной способностью формировать биопленку. Так, увеличилась доля выделения S. aureus c отсутствием или низким уровнем активности?– до?40% (n=13) и?30% (n=10) случаев соответственно (относительно 7,5% при первичном исследовании, ?2=8,6; р=0,003; ?2=4,5; р=0,03). В?то?же время доля обнаруженных штаммов с?высокой предрасположенностью к?образованию биопленки снизилась до?15% (n=6) по?сравнению с?исходными 70% (?2 =19,6; р<0,001) (рис. 2).
Как известно, воздействие низкочастотным ультразвуком является одним из?наименее травматичных видов дебридмента, который позволяет очистить рану от?контаминированных бактериями нежизнеспособных тканей, фибрина и?детрита. За?счет сочетания эффектов кавитации и?вибрации ультра­звук оказывает прямое бактерицидное действие. Экспериментально доказано, что низко­частотный ультразвук разрушает внеклеточный матрикс биопленки, вследствие чего бактерии в?ране становятся доступными для факторов иммунной защиты макро­организма. Использование в?процессе лечения низкодозированного отрицательного давления приводит к?удалению экссудата, что препятствует адгезии микроорганизмов [1]. В?итоге создаются помехи для реконтаминации раны микробами, то?есть идет воздействие на?самые ранние стадии формирования биопленки?– адгезию бактерий, их пролиферацию, появление микроколоний, начальный синтез ЭПМ. Следовательно, микробный кластер просто не?успевает образовываться. При применении нашего метода анализа эффективность аппаратной терапии на?начальных этапах создания биопленки может быть оценена по?оптической плотности растворов красителей, измеренной через 2, 4, 6, 18 ч инкубации.
Лечение в?группе 2, с?использованием только стандартных повязок с?антисептическими препаратами и?мазями на?полиэтиленгликолевой основе, не?сопровождалось изменением способности S. aureus формировать биопленку. Так, аналогично результатам, полученным на?момент поступления, штаммы стафилококка, выделенные из?ран пациентов при интраоперационном исследовании (перед АДП), с?наибольшей частотой (75%, n=13) демонстрировали выраженную склонность к?биопленкообразованию. В?25% случаев (n=4) регистрировались штаммы с?умеренным таким свойством. Необходимо отметить, что перед проведением пластического закрытия ран в?группе 2 не?обнаруживались штаммы S. aureus с?низкой или отсутствием способности формировать биопленку.
Таким образом, аппаратные методы лечения создают благоприятные условия для заживления за?счет повреждающего действия ультразвука, отрицательного давления на?биопленку в?ране и?активирующего влияния на?механизмы иммунной защиты. У?всех пациентов группы 1 после аппаратной терапии исход АДП был успешным: полная фиксация лоскута происходила к?3–4-му дню послеоперационного периода с?полным приживлением на?7–9-е сутки. Это позволяет сделать вывод, что незначительный слой ЭПМ (перед проведением АДП выделялся S. aureus с?отсутствием или низкой способностью формировать биопленку) не?создает препятствия для воздействия факторов иммунитета и?не?мешает заживлению, поэтому контаминация ран S. aureus не?сопровождается развитием инфекционного процесса или нарушением приживления пересаженного лоскута.
Штаммы S. aureus, выделенные из?ран пациентов при интраоперационном исследовании и?обладающие, согласно разработанной нами методике, низкой способностью к?образованию биопленки, дополнительно анализировались посредством атомно-силовой микроскопии. На?рис. 3 представлены трехмерный микро­рельеф поверхности микробного конгломерата и?ее вертикальный профиль, полученные после обработки результатов сканирования с?помощью специальной компьютерной программы. Видно, что для биопленки S. aureus, выделенного из?раны перед АДП, характерно преимущественное скопление микробных тел и?отсутствие основного вещества.
В свою очередь, у?четырех пациентов группы 2, которых лечили только с?использованием стандартных повязок, в?послеоперационном периоде наблюдался лизис: к?3–4-м суткам сохранялась бледность и?нестабильность лоскута с?его отторжением к?7–8-му дню. При интра­операционном исследовании из?ран выделялся S. aureus с?выраженной способностью формирования биопленки. Необходимо отметить, что лизис лоскута не?сопровождался признаками активации инфекционного процесса?– отделяемое из-под лоскутов было серозным или отсутствовало, состояние окружающих рану тканей не?изменялось. Это позволяет предположить, что наличие в?ране S. aureus, способного быстро (в период с?2 до?4 ч инкубации in vitro) накопить и?сформировать (к 24 ч инкубации in vitro) выраженный слой ЭПМ, мешает дальнейшей фиксации и?приживлению лоскута. На?рис. 4 представлены результаты визуализации такой биопленки (из ран пациентов с?лизисом лоскута), образованной после 24-часовой инкубации. Она характеризуется небольшим количеством микробных тел, погруженных в?слой экзополисахаридного матрикса.
Таким образом, предложенный в?данной статье метод рекомендуется для обоснования выбора лечения пациентов с?хроническими ранами. Обнаружение S. aureus с?высокой или умеренной способностью формировать биопленку является показанием для применения аппаратной терапии в?целях подготовки раны к?пластическому закрытию (ультразвуковая и/или вакуум-терапия), в?случае низкой такой способности или ее отсутствия рекомендуется использовать консервативное лечение.
Разработанный нами метод сочетает в?себе два основных подхода к?изучению образования бактериальной биопленки: динамический (оценка основных этапов формирования после 2, 4, 6, 18, 24, 48 ч инкубации) и?статический (одновременная оценка основных моментов, характеризующих биопленку: накопления биомассы и?синтеза ЭПМ). Он позволяет получить заключение менее чем за?двое суток, что приближает его к?классическому бактериологи­ческому исследованию и?делает возможным использование в?клинической лабораторной микробиологии. Определение результатов сразу после окончания каждого периода инкубации в?предложенном способе напоминает детекцию в?режиме реального времени.
Метод является простым и?доступным, исключает необходимость эксплуатации специального дорогостоящего оборудования и?трудно­доступных красителей. Это обеспечивает возможность его широкого применения в?работе бактериологических отделов клинико-­диагностических лабораторий для распознавания инфекций, в?патогенезе которых ключевое значение имеет биопленка, а?также обоснования различных путей их лечения и?мониторинга эффективности.

Статья поступила в?редакцию 03.02.2016?г.

Summary
It is presented the new laboratory method of detection of bacterial biofilm formation in the article. All the examined strains of bacteria are divided into the following categories: no biofilm producers, weak, moderate, or strong biofilm producers accordingly the digital data of the optical density measured for stained with crystal violet and Congo red bacterial films. The described method will be useful in medical practice for the diagnostics of the biofilm-related infection: healthcare-associated infection, device-related infections, chronic tissue infections and for the optimization of the infection treatment protocols.

Литература
1. Wolcott R.?The role of biofilms: are we hitting the right target? Current concepts in wound Healing: Update 2011 / R.?Wolcott, S.?Down // Plastic and reconstructive surgery. 2011. Vol. 127, N1S. P. 28S–37S.
2. Lebeaux D.?From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections / D.?Lebeaux [et al.] // Pathogens. 2013, N2. P. 288–356.
3. Distribution, organization, and ecology of bacteria in chronic wounds / K.?Kirketerp-M?ller // J Clin Microbiol. 2008. Vol. 46, N8. P. 2717–2722.
4. Ярец?Ю.?И.?Динамика микробного состава хронической раны с?учетом особенностей предоперационной подготовки / Ю.?И.?Ярец, Н.?И.?Шевченко, Л.?Н.?Рубанов // Проблемы здоровья и?экологии. 2012. Т. 32, №?2. С. 108–114.