Открытие учеными Института инфекционной биологии Общества им. Макса Планка (Берлин, Германия) в 2004?г. нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей (NETs), безусловно, послужило началом нового этапа в понимании жизненного цикла, функций нейтрофильных гранулоцитов (НГ) и их роли в иммунологической резистентности организма [1]. Процесс образования NET (нетоз) представляет собой формирование во внеклеточном пространстве сетеподобных структур (так называемых ловушек), состоящих из нитей ДНК, гистонов и компонентов гранул в ответ на Toll- и лектин-опосредованные стимулы (антигены бактерий, грибов, простейших, провоспалительные цитокины, аутоантитела и др.) [2, 3]. Большинство перечисленных стимуляторов запускают наиболее универсальный путь нетоза, сопровождающийся активацией NADPH-зависимой генерации активных форм кислорода [4]. В то же время установлено, что активация NADPH-оксидазной системы является обязательным, но не достаточным условием для формирования NET. Так, в крови детей до 6 лет, несмотря на адекватное функционирование NADPH-оксидазного комплекса, они не образуются [5].
Известно несколько источников происхождения ДНК нейтрофильных сетей: образование NETs, состоящих из нитей ядерной ДНК (при этом НГ погибает); экструзия ДНК митохондриального происхождения; внеклеточный выброс везикул с включенным в них деконденсированным хроматином [2] (в последних двух случаях НГ сохраняет свою жизнеспособность). В исследованиях in vitro продемонстрировано, что время, необходимое для формирования NET, составляет, в зависимости от источника ДНК и стимула, от 10 минут до 4 часов [1, 4]. Наиболее изученный механизм нетоза?– процесс классической экструзии ДНК ядерного происхождения. Мониторинг NET-образования, стимулированного форболмиристатацетатом, с помощью методов трансэмиссионной и конфокальной флуоресцентной микроскопии показал, что в течение первых 60 минут с момента NADPH-зависимой стимуляции НГ уплощаются и происходит вакуолизация их цитоплазмы. На 80-й минуте из азурофильных гранул выделяются и перемещаются к ядру клетки нейтрофильная эластаза и миелопероксидаза, вызывающие цитруллирование ядерных гистонов, гомогенизацию эу- и гетерохроматина с последующим разрушением оболочки ядра и мембран цитоплазматических гранул [3, 6]. Несмотря на дальнейшее перемешивание содержимого всех клеточных компартментов, в составе NET обнаруживают не более 30 различных белков. Показано, что в NET, кроме ДНК и ядерных гистонов, входят компоненты первичных (нейтрофильная эластаза, миелопероксидаза, дефензины, катепсин G, кателицидин LL37), вторичных (лактоферрин, PTX3, BPI-белок) и третичных гранул (металлопротеиназа 9, PGRP-S), обладающие выраженной антибактериальной активностью [6]. В дальнейшем на 220-й минуте клеточная мембрана дезинтегрируется и происходит выброс высокоактивной сети наружу. Интересно отметить, что экструзия NET всегда направлена строго к источнику раздражения и реализуется через скоординированное во времени и пространстве взаимодействие между микротрубочками и актиновыми филаментами цитоскелета нейтрофильных гранулоцитов [2].
В настоящее время дискутируется вопрос о том, как NET-образующая способность НГ соотносится с ранее известными проявлениями их функциональной активности. В условиях ex vivo было установлено, что нейтрофилы захватывают бактерии (S. aureus) сначала путем фагоцитоза, затем, спустя 3–4 часа после стимуляции,?– посредством NETs [7, 8]. Это дает основание предполагать, что в условиях in vivo нетоз представляет собой резервную форму киллинга микроорганизмов в случае неэффективного фагоцитоза. Кроме того, при сравнительных исследованиях, проведенных российскими учеными, было отмечено, что эффективность захвата и киллинга бактерий с помощью NETs выше, чем при фагоцитозе [9]. Преимущества нетоза как механизма бактерицидности?– создание дополнительного физического барьера, препятствующего распространению патогенов (особенно слишком крупных для фагоцитоза), а также минимальные повреждения окружающих тканей [1, 7].
Спектр заболеваний, при которых выявлены изменения NET-образующих свойств НГ, достаточно широк (табл. 1), однако клиническая значимость нетоза при ряде патологических состояний пока не ясна. При аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка (СКВ), микроскопический полиангиит) NETs рассматривают как один из факторов тяжелого течения и неблагоприятного прогноза [10]. Так, показано, что присоединение инфекции при СКВ приводит к повышению титра антинуклеарных антител за счет инициации образования NETs, при этом увеличение количества экстрацеллюлярных сетей коррелирует с развитием люпус-нефрита [11]. При сердечно-сосудистых заболеваниях (атеросклероз, инфаркт миокарда, инсульт и др.) избыточное формирование и/или замедленная элиминация NETs (как следствие нарушения синтеза либо снижения активности ДНКазы?I) предположительно являются отражением степени эндотелиальной дисфункции, которую в настоящее время рассматривают в качестве раннего маркера атеросклероза и атеротромбоза [12]. В противоположность этому, при тропической малярии, легочном аспергиллезе увеличение NETs играет защитную роль, когда патоген слишком велик для фагоцитоза гранулоцитами [2, 13]. Имеются сообщения об участии NET в механизмах метастазирования путем захвата циркулирующих опухолевых клеток [8]. При тяжелой форме сепсиса массивное образование NETs, вызванное взаимодействием активированных тромбоцитов с НГ, ассоциировано со степенью окклюзии сосудов микроциркуляторного русла и полиорганной недостаточности [14]. У пожилых людей и новорожденных выявлен ранее не описанный иммунодефицит, обусловленный нарушением NET-образования и сопровождающийся высокой восприимчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям [15, 16].
Процесс нетоза вызывает интерес у специалистов различного профиля, что делает актуальным разработку и совершенствование методик оценки NET-образования для дальнейшего включения в стандартное клинико-лабораторное обследование. В связи с изложенным нами впервые в Республике Беларусь была предпринята попытка создания метода изучения NET-образующей функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови [17].
Большинство способов определения нетоза базируется на выявлении компонентов нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей путем люминесцентной микроскопии. Используют флуорохромы, непосредственно связывающиеся с экстрацеллюлярной ДНК (Dapi, SYTO 13, Sytox Orange, Sytox Green, акридиновый оранжевый, пропидиум йодид), либо меченные флуорохромом моноклональные антитела против гистонов, нейтрофильной эластазы, миелопероксидазы, кателицидинов и др. [18]. Вместе с тем применение флуоресцентной микроскопии создает ряд технических проблем, поскольку исключает возможность фиксации клеток и, как следствие, препятствует отсроченному анализу. Кроме того, для получения воспроизводимых результатов необходимо выдерживать строгие условия прокраски биологических объектов (рН, ионную силу, концентрацию, точное соотношение мономеров и димеров флуорохрома). Флуоресцентные красители обладают высокой канцерогенной активностью и низкой светоустойчивостью, не позволяющей длительно хранить окрашенные препараты. Использование люминесцентного микроскопа целесообразно только в крупных клинико-диагностических центрах, ежедневно выполняющих большое количество работ. Поэтому вопрос об оптимизации способов визуализации NET для обеспечения применения в рутинной лабораторной практике остается открытым.
В период 2011–2016?гг. нами проведен сравнительный анализ методов визуализации NET c использованием флуоресцентного красителя акридинового оранжевого и традиционной окраски по Романовскому?– Гимзе с целью упрощения и широкого внедрения в клиническую практику данного вида исследований для оценки состояния иммунной системы. Все работы выполнялись в клинико-диагностической лаборатории и лаборатории клеточных технологий РНПЦ радиационной медицины и экологии человека и расположенной на их базе кафедре клинической лабораторной диагностики, аллергологии и иммунологии Гомельского государственного медицинского университета. В исследование была включена группа пациентов (n=67) с хроническим рецидивирующим фурункулезом (ХРФ) тяжелого течения в стадии ремиссии, находившихся на стационарном лечении в отделении иммунопатологии и аллергологии РНПЦ РМиЭЧ. Их возраст колебался от 18 до 49 лет. Продолжительность заболевания составляла от года до 17 лет, частота рецидивирования?– 6 и более раз в год. В другую анализируемую группу вошли 70 пациентов в возрасте от 20 до 75 лет с хроническими ранами (ХР) различной этиологии и сроков давности, госпитализированных в ожоговое отделение Гомельской городской клинической больницы №1 за период 2011–2016?гг. Давность существования ран составила от 4 недель до года и более. В контрольную группу были включены 73 сопоставимых по возрасту и полу практически здоровых человека.
Лейкоциты получали из гепаринизированной (10 Ед/мл) венозной крови путем отстаивания в течение 45 мин. при 37 °C. Интенсивность процессов нетоза оценивали по методике И.?И.?Долгушина [9] в нашей модификации. Клеточную взвесь инкубировали в течение 150 мин. при 37 °C в среде RPMI 1640 без стимулятора (спонтанный уровень; NETсп) и в присутствии растворимых продуктов S. аureus (стимулированный уровень; NETст). Способ получения таких продуктов и подбор оптимальной концентрации для стимуляции функциональных свойств НГ описан нами ранее [17]. После инкубации клеточную суспензию центрифугировали 5 мин. при 250 g, осадок ресуспензировали и делали тонкие мазки. Затем предметные стекла фиксировали 96-градусным этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому?– Гимзе (в ряде экспериментов?– 0,04%-ным водным раствором акридинового оранжевого). Микроскопировали с использованием иммерсионного увеличения (?1000), подсчет производили в щеточной каемке (считали процентное содержание NET при просмотре 200 НГ). Статистический анализ осуществлялся на основании непараметрических методов, результаты выражались в виде Me (25%; 75%), где Me?– медиана, 25%?– нижний квартиль, 75%?– верхний. Различия считались значимыми при р<0,05.
На первом этапе работы мы провели сравнение уровня NET при применении выбранных нами способов окраски. Для этого из клеточного осадка готовили 2 мазка, один из которых окрашивали 0,04%-ным водным раствором акридинового оранжевого, а второй?– по Романовскому?– Гимзе. Полученные результаты представлены на рис. 1. Как видно, сопоставление воспроизводимости количества NET методом парных сравнений с использованием непараметрического W-критерия Вилкоксона показало отсутствие между ними значимых различий. При этом количество NET составило 5,0% (5,0; 6,0) и 5,0% (4,0; 6,0) при окраске по Романовскому?– Гимзе и акридиновым оранжевым соответственно.
В отдельных препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым, мы фиксировали координаты обнаруженных NET, а затем производили докраску этого же мазка по Романовскому?– Гимзе с последующей микроскопией. При этом образования, идентифицируемые как с помощью люминесцентной, так и световой микроскопии, имели сходные морфологические признаки и были представлены тонкими свободнолежащими внеклеточно расположенными фибриллярными структурами (рис. 2). Как видно, при окраске мазков акридиновым оранжевым, который специфически связывается с ДНК, NET выглядели как тонкие флуоресцирующие внеклеточные волокна, занимающие пространство, в 2–3 раза превосходящее диаметр неизмененного НГ. При микроскопии препаратов, окрашенных по Романовскому?– Гимзе, мы наблюдали образования в виде тонких свободнолежащих нитей сине-фиолетового цвета (из-за щелочного компонента красителя азур II), которые расценивали как NET.
Проведенные тесты показали, что для индикации NET может быть использован метод окрашивания препаратов по Романовскому?– Гимзе с последующей визуализацией с помощью иммерсионной световой микроскопии. Этот способ прост, не требует специфических реактивов и оборудования и может быть внедрен практически в любой клинико-диагностической лаборатории. Он позволяет не только определить наличие экстрацеллюлярных сетей, но и количественно охарактеризовать данное явление, так как хорошо различима морфология сформировавшихся структур и нейтрофилов, относительно которых ведется подсчет NET.
На следующем этапе работы мы изучали NET-образующую способность нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулезом и хроническими ранами. Полученные результаты представлены в табл. 2. Как видно из нее, анализ NET-образующих свойств НГ у пациентов с ХРФ выявил значимое увеличение NET в ответ на стимуляцию растворимыми продуктами S. аureus (p<0,001). В условиях хронического раневого процесса способность НГ пациентов к нетозу как при отсутствии стимуляции (NETсп), так и для стимулированных клеток (NETст) оказалась выше, чем у здоровых лиц, на 60% и 50% соответственно (р<0,001).
Выявленные изменения дают основания рассматривать нетоз не только как вариант реализации программированной гибели клетки, но и как один из механизмов внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов, когда, погибая, они по-прежнему защищают организм от инфекции путем создания дополнительного физического барьера.
Таким образом, нами разработан экономичный метод визуализации NET с применением традиционной окраски по Романовскому?– Гимзе, позволяющий широко внедрять в клиническую лабораторную практику исследование нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей. Установлено увеличение стимулированной NET-образующей способности нейтрофилов у пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулезом в стадии ремиссии. У пациентов с хроническими ранами регистрируется увеличение спонтанного и стимулированного формирования NET.
Статья поступила в редакцию 04.10.2016?г.

SUMMARY
A simple and available for use in a clinical laboratory method for visualization of neutrophil extracellular traps was developed and studied his performance in patients with chronic recurrent furunculosis, chronic wounds and healthy volunteers in the spontaneous and stimulated test version. Described method allows to define presence and morphology of the NETs, as well as quantitatively to characterize this phenomenon due to well distinguishable structure of generated NETs.

ЛИТЕРАТУРА
1. Brinkmann?V.?Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. 2004. Vol. 303. Р. 1532–1535.
2. Nel?J.?G.?Neutrophil extracellular traps and their role in health and disease / J.?G.?Nel [et al.] // South African Journal of Science. 2016. Vol. 112, N1/2. Р. 1–9.
3. Fuchs?T.?A.?Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // The Journal of Cell Biology. 2007. Vol. 176. Р. 231–241.
4. Zychlinsky A.?Neutrophil elastase and myeloperoxidaze regulate the formation of neutrophil extracellular traps / A.?Zychlinsky, K.?D.?Metzler // The Journal of Cell Biology. 2010. Vol. 25. Р. 1–15.
5. Fadeel B.?Babies born without safety NET // Blood. 2009. Vol. 113, N25. Р. 6270–6271.
6. Kolaczkowska E.?Neutrophil recruitment and function in health and inflammation / E.?Kolaczkowska, P.?Kubes // Immunology. 2013. Vol. 13. Р. 159–175.
7. Brinkmann?V.?Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs / V.?Brinkmann, A.?Zychlinsky // Nature Reviews Microbiology. 2007. Vol. 5. Р. 577–582.
8. L?gters T.?The clinical value of neutrophil extracellular traps / T.?L?gters [et al.] // Med Microbiol Immunol. 2009, N198. Р. 211–219.
9. Долгушин?И.?И.?Технологии определения и роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в антимикробной защите / И.?И.?Долгушин, Ю.?С.?Шишкова, А.?Ю.?Савочкина // Вестник РАМН. 2010, №?4. С. 26–30.
10. Knight?J.?S.?Proteins derived from neutrophil extracellular traps may serve as self-antigens and mediate organ damage in autoimmune diseases / J.?S.?Knight, C.?Carmona-Rivera, M.?J.?Kaplan // Frontiers in immunology. 2012. Vol. 3, N14. Р. 1–12.
11. Hakkim A.?Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis / A.?Hakkim [et al.] // PNAS. 2010. Vol. 107, N21. Р. 9813–9818.
12. Fuchs?T.?A.?Extracellular DNA traps promote thrombosis / T.?A.?Fuchs [et al.] // PNAS. 2010. Vol. 107, N36. Р. 15880–15885.
13. Bruns S.?Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin roda / S.?Bruns [et al.] // PLОS Pathogens. 2010. Vol. 6. Р. 3–7.
14. Pinheiro da Silva F.?Cell death during sepsis: integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection / F.?Pinheiro da Silva, V.?Nizet // Apoptosis. 2009, N14. Р. 509–521.
15. Yost?C.?C.?Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: а novel innate immune deficiency of human neonates / C.?C.?Yost [et al.] // Blood. 2009. Vol. 113, N25. Р. 6419–6427.
16. Hazeldine J.?Impaired neutrophil extracellular trap formation: а novel defect in the innate immune system of aged individuals / J.?Hazeldine [et al.] // Aging Cell. 2014. Vol. 13, N4. Р. 690–698.
17. Гусакова?Н.?В.?Образование экстрацеллюлярных сетей нейтрофилами периферической крови / Н.?В.?Гусакова, И.?А.?Новикова // Проблемы здоровья и экологии. 2011. Т. 29, №?3. С. 27–31.
18. Brinkmann?V.?Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them / V.?Brinkmann [et al.] // Journal of Visualized Experiments. 2010, N1. Р. 1–3.