Криоконсервация бифидобактерий

Бифидобактерии — непатогенные микробы, оказывающие положительное воздействие на организм хозяина. Одно из направлений исследований данной группы микроорганизмов — разработка эффективных методов хранения коллекционных и производственных штаммов. Надежным способом является криоконсервация, или глубокая заморозка в жидком азоте, влияние которой на сохранность основных морфофункциональных свойств и жизнеспособность штаммов бифидобактерий изучают заведующая лабораторией «Коллекция микроорганизмов» Института микробиологии НАН Беларуси кандидат биологических наук Галина Новик и младший научный сотрудник Анастасия Сидоренко.
Экономичность, низкая трудоемкость, отсутствие существенных потерь жизнеспособности и необходимости длительной реактивации культур обусловливают перспективность использования криоконсервации. Согласно литературным данным, повреждения клеток или их отдельных структур возникают в основном на этапах замораживания — отогрева, тогда как во время хранения дополнительных изменений свойств микроорганизмов, как правило, не происходит. Поэтому при разработке методик большое внимание уделяют подбору наилучших параметров охлаждения и эффективных защитных сред с учетом физиологических и структурных особенностей конкретных штаммов микроорганизмов.
Предполагается, что существует оптимальная скорость замораживания, которая находится на границе двух диапазонов: во-первых, приводящих к обезвоживанию клетки, во-вторых, вызывающих появление внутриклеточного льда. Экспериментально установлено, что она связана со структурно-функциональными свойствами клеток: размером, проницаемостью мембраны для молекул воды, строением клеточной стенки.
Использование эффективных защитных сред позволяет значительно расширить диапазон скорости охлаждения без существенного снижения жизнеспособности микроорганизмов. В практике низкотемпературной консервации биологических объектов наиболее часто применяют такие протекторы (протекторные среды), как глицерин, сахара, пептон, дрожжевой экстракт, яичный желток, глутамат и аспартат натрия, обезжиренное молоко и др. Механизмы их защитного действия разнообразны и в полной мере еще не раскрыты.
Сотрудниками лаборатории изучена выживаемость бифидобактерий при криоконсервации в зависимости от условий культивирования, охлаждения, состава защитной среды, а также исследовано влияние различных режимов и суспензионных сред на жизнеспособность и сохранность основных морфофункциональных свойств клеток. Объектами изысканий служили штаммы бактерий, в том числе депонированные в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов.
Для изучения различных режимов замораживания криоконсервации подвергали 18—20-часовые физиологически активные культуры. При быстром охлаждении образцов путем погружения в жидкий азот количество жизнеспособных клеток было минимально, но с уменьшением скорости число живых бифидобактерий увеличивалось. Показатели накопления биомассы и активности кислотообразования культур, замороженных в разных режимах, существенно не отличались от величин, полученных при культивировании нативных клеток. В то же время после низкотемпературной консервации отмечалось снижение активности развития бифидобактерий в стерильном молоке, что отражалось в увеличении времени, необходимого для сквашивания, а также уменьшении кислотности образованного сгустка. Исходная скорость роста восстанавливалась через 18—20 часов культивирования клеток в тиогликолевой среде и среде Де Мана с L-цистеин-гидрохлоридом. Причем последняя обладала наибольшим защитным действием и обеспечивала сохранение исходной жизнеспособности и функциональных характеристик культур независимо от скорости охлаждения, тогда как криозащитный эффект пептонной воды был хорошо выражен при медленном замораживании и в значительно меньшей степени проявлялся при быстром.
Изучение морфологических свойств бифидобактерий на светооптическом и электронно-микроскопическом уровне показало, что после криоконсервации морфология исследуемых микроорганизмов существенных изменений не претерпевала.
Полученные данные свидетельствуют о высокой устойчивости бактерий рода Bifidobacterium к повреждающим факторам, действующим на этапах замораживания. Это частично обусловлено морфофункциональными особенностями данных микроорганизмов, в частности высоким содержанием фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот в составе клеточных мембран. Кроме того, более высокая криорезистентность одного вида бактерий в сравнении с другим характеризуется наличием полисахаридной капсулы, выполняющей дополнительную защитную функцию.
На основании полученных данных ученые сделали вывод, что оптимальным режимом замораживания бифидобактерий является медленное охлаждение. Лучшая суспензионная среда — среда Де Мана, традиционно используемая для культивирования этих бактерий, обеспечивающая сохранность исходной жизнеспособности и морфофункциональных свойств данных микроорганизмов независимо от скорости охлаждения.
Полученные результаты имеют практическое значение и могут применяться для хранения производственных и коллекционных штаммов рода Bifidobacterium, а также оптимизации биотехнологических процессов с использованием данных микроорганизмов. На разработанный способ криоконсервации получен патент Республики Беларусь.