Геномная регистрация живых организмов приобретает все большую актуальность. Активно идет разработка методов генотипирования растений и животных, ценных как с экологической, так и с сельскохозяйственной точки зрения. Осуществляются попытки создания генетических паспортов для различных биологических объектов. Масштабность и важность данной тенденции иллюстрируется также тем, что во многих странах уже введены законы, протоколирующие и регулирующие этот процесс (например, Закон «О государственной геномной регистрации в РФ» от 03.12.2008 г.) [1].
Ценность генетического типирования состоит в том, что оно позволяет достоверно определить таксономическую принадлежность организмов вплоть до уровня популяции, штамма; оценить уровень полиморфизма, его изменение, что важно для разработки мероприятий по сохранению биоразнообразия в дикой природе [2, 3]. В случае паспортизации сельскохозяйственных видов животных оно также дает возможность точно идентифицировать породу, что имеет огромное экономическое значение. Яркий пример эффективного использования такой паспортизации — работа российских генетиков, позволившая выявить подлог с ропшинским карпом. Среди рыбоводов эта порода завоевала популярность своей зимостойкостью, неприхотливостью и плодовитостью, хорошими вкусовыми качествами. Для выращивания рыб, как правило, вначале покупается сертифицированный материал — икра или мелкие мальки. На этом этапе некоторые нечестные продавцы пытаются обмануть покупателей, выдавая неизвестных мальков за ропшинского карпа и стараясь вместо одной породы продать другую, в частности менее зимостойкую. Выявить подлог в таком случае позволяет только генотипирование и последующее сравнение полученных данных с генетическим паспортом заявленной породы [4].
В области рыбоводства до сих пор в целях паспортизации породы в основном использовались биохимические маркеры (например, у карпа — определение полиморфизма генов по локусу трасферринов). В то же время с помощью методов ДНК-типирования (RAPD-маркеры и микросателиты [5—8]) зарубежными исследователями в последние годы выявлена высокая геномная вариабельность некоторых европейских (Венгрия) и азиат¬ских (Китай) пород карпа. В странах СНГ лишь в России проводились единичные исследования местных и европейских пород этой рыбы методом мультилокусного геномного типирования [9].
Генетическое тестирование имеет пожизненную информационную ценность. Его необходимо осуществлять один раз. Результаты стабильны и не зависят от эпигенетических факторов.
Единого протокола для составления генетического паспорта индивидуума или породы не существует. Возможно, это связано с тем, что работы по данному вопросу начали проводить не так давно и объем сведений о геномах различных организмов находится на разном уровне. Для некоторых уже известна полная последовательность генома, для других собраны лишь частичные данные или их вообще нет.
Процесс определения генотипа индивидуума осуществляется с помощью биологических методов. К данным методам относятся ПЦР, ДНК-секвенирование, гибридизация, ДНК-микрочипы и др. [10].
На сегодняшний день генетическая паспортизация, как основа геномной регистрации ресурсных видов растений и животных, нуждается в более рацио¬нальных подходах, базирующихся на молекулярном маркировании геномов. Для генетического типирования используются различные варианты молекулярных маркеров — RFLP (англ. Restriction Fragment Length Polymorphism — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA — случайная амплификация полиморфной ДНК), AFLP (англ. Amplified Fragment Length Polymor-
phism — полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов), ISSR (англ. Inter-Simple Sequence Repeat — участки генома между микросателлитными локусами), SSR или микросателлиты (англ. Simple Sequence Repeats — тандемные повторы) и др., каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки [11].
Целью наших исследований была разработка технологии генетического паспорта белорусского карпа по результатам молекулярного маркирования как научно-методической основы геномной регистрации исследуемых пород для их идентификации, использования потенциала и оптимизации сохранения генофондов. Исследования проведены в рамках задания 4.4.7 «Оценить генетическое разнообразие и создать эколого-генетические и молекулярно-биологические паспорта карпа белорусской селекции» ГП «Биотехнология».
Объектом исследования являлись 2—3-годовалые особи лахвинской и тремлянской породных групп карпа (зеркальная и чешуйчатая отводки), выловленные в феврале — октябре 2009 г. в прудах рыбхозов «Лахва» и «Тремля» соответственно. Выборка осуществлялась из товарной рыбы.
Для разработки генетического паспорта белорусского карпа в качестве молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК и проанализировать большую часть генома карпа, были выбраны RAPD-маркеры. Данная технология недорогая и доступная для массового анализа. Метод не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагментов для подбора праймеров. Это тем более важно, что данных по последовательности генома карпа у нас не имеется. Пока установлена только полная первичная последовательность митохондриального генома карпа и исследован полиморфизм его отдельных участков в азиатских и европейских популяциях [7—8, 12—13].
Для предварительного анализа были избраны 7 праймеров с целью выявить среди них эффективные, пригодные для идентификации изучаемых нами пород (табл. 1).
Выделение ДНК осуществлялось из законсервированных в 96%-ном этаноле плавников карпа (10—13 особей каждой отводки) методом фенол-хлороформной экстракции. Концентрацию и чистоту ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro UV/Visible (Biochrom Ltd.), качество проверяли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле (SeaKem® LE Agarose, LONZA).
Амплификацию проводили на амплификаторе МyCycler™ (BioRad). Ее продукты подвергали электрофоретическому разделению в 2%-ном агарозном геле в устройстве для горизонтального электрофореза Vagophor 11 (Эстония). Гель окрашивали в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 20 мин. Визуализацию геля осуществляли с помощью системы документирования гелей GelDoc XR (Bio-Rad, США). Полученные изображения обрабатывали с использованием программы Quantity One 4.4.
Статистическая обработка экспериментальных данных по генотипированию осуществлялась с применением программы Statistica 6.0.
В данной статье мы приводим только результаты, полученные по праймеру 21 (5?-GGATCCGAGGGTGGCGGTTCT-3?) — одному из наиболее эффективных, показавшему свою пригодность для идентификации исследуемых нами пород.
При проведении RAPD-анализа чешуйчатой и зеркальной отводок лахвинской породы карпа по праймеру №21 были получены 36 типов ампликонов, большинство из которых присутствовало у обеих отводок лахвинского карпа. Внимания заслуживает фрагмент в 525 п.о. (пар оснований) (присутствовал только у зеркальной отводки лахвинского карпа, у 2 образцов из 10) и фрагмент в 1821 п.о. (присутствовал только у чешуйчатой отводки лахвинского карпа, у 4 образцов
из 10) (рис. 1), лишь эти ампликоны встречались в одной из отводок в количестве больше 1 на всю выборку.
Данные ампликоны при более детальных исследованиях могут претендовать на роль молекулярно-генетических маркеров для идентификации зеркальной и чешуйчатой отводок лахвинского карпа. Также следует отметить значительные частотные отличия между двумя вышеупомянутыми отводками лахвинского карпа по ампликонам в 2066 и 895 п.о.: у чешуйчатой отводки ампликон в 2066 п.о. присутствовал у 40% исследуемых особей, в то время как у зеркальной отводки только у 10%. Ампликон 895 у чешуйчатой отводки встречался с частотой 40%, у зеркальной отводки — с частотой 70%. Возможно, данные различия также могут быть использованы в качестве дополнительных критериев идентификации отводок.
При сравнении спектра ампликонов по праймеру №21 лахвинской зеркальной и тремлянской зеркальной пород карпа получены следующие результаты: обнаружены различия по 15 типам ампликонов между этими двумя породами, однако внимания заслуживают только несколько из них. У особей лахвинской зеркальной породы присутствует ПЦР-фрагмент в 922 п.о. (с частотой 40%), в то время как у тремлянской зеркальной (рис. 2) данный фрагмент отсутствует полностью. У нее обнаружены ампликоны в 1873 (с частотой 40%), 681 (с частотой 50%) и 615 п.о. (с частотой 70%). Данные ампликоны полностью отсутствуют у особей лахвинской зеркальной породы карпа.
Особое внимание следует уделить ампликону в 362 п.о., который на 100% присутствует в лахвинской зеркальной пароде и на 100% отсутствует в тремлянской зеркальной породе карпа.
Сводный набор спектров и частот ампликонов по праймеру №21 лахвинской зеркальной, лахвинской чешуйчатой, тремлянской зеркальной и тремлянской чешуйчатой пород карпа приводится в табл. 2. Из нее видно, что RAPD-анализ всех четырех пород карпа по праймеру №21 в сумме дал 50 типов ампликонов.
Среди полученных ампликонов для лахвинской зеркальной породы карпа оказался характерным (то есть не встречался ни у одного образца из выборок других пород) только один ампликон в 1703 п.о., который у анализируемой выборки из породы присутствовал с частотой 10%. Однако частота встречаемости низкая, так что этот ампликон не стоит рассматривать как возможный вариант молекулярного маркера для идентификации или паспортизации породы.
Для лахвинского чешуйчатого карпа характерными оказались три ампликона: 2190 (10%), 1923 (10%) и 1821 п.о. (40%). Среди них заслуживает внимания для дальнейшего рассмотрения в качестве возможного вспомогательного маркера характеристики породы ампликон в 1821 п.о., так как он присутствует в выборке с приемлемой частотой.
Для тремлянской зеркальной породы карпа являются характерными 5 ампликонов: 2226 (10)%, 1679 (10%), 1538 (60%), 1364 (10%) и 681 п.о. (50%). Для характеристики породы пригодны только ампликоны 1538 и 681 п.о.
Для тремлянского чешуйчатого карпа специфическими оказались 6 ампликонов: 1571 (84,62%), 1098 (15,38%), 1040 (30,77%), 1002 (15,38%), 967 (53,85%) и 931 п.о. (53,85%). Для характеристики породы пригодны только ампликоны 931, 968 и 1040 п.о. Особое внимание следует уделить ампликону 1571, который позволяет идентифицировать породу практически на уровне единичной особи.
Специфическими для тремлянской породы карпа (то есть присутствуют у особей данной породы обеих отводок, и полностью отсутствуют у особей лахвинской породы обеих отводок) являются три ампликона: 1873 п.о. (встречался у 40% анализируемых особей зеркальной отводки и у 7,69% особей чешуйчатой отводки), 1495 п.о. (у 20% анализируемых особей зеркальной и у 76,92% особей чешуйчатой отводки), 615 п.о. (у 70% анализируемых особей зеркальной и у 30,77% особей чешуйчатой отводки). Все данные ампликоны могут использоваться для характеристики породы.
Специфическими для лахвинской породы карпа оказались 4 ампликона: 1517 п.о. (встречался у 90% анализируемых особей зеркальной и у 100% особей чешуйчатой отводки), 1330 п.о. (у 20% анализируемых особей зеркальной и у 30% особей чешуйчатой отводки), 390 п.о. (у 10% анализируемых особей зеркальной и у 10% особей чешуйчатой отводки), 362 п.о. (у 100% особей зеркальной и у 90% особей чешуйчатой отводки). Пригодными для характеристики породы являются только ампликоны 1517, 1330 и 362. Следует обратить особое внимание на маркеры 1517 и 362, которые в 100% присутствовали у особей данной породы обеих отводок, так как они могут оказаться молекулярными маркерами, позволяющими идентифицировать породу на уровне единичной особи.
Также был выявлен ампликон, характерный только для зеркальной отводки обеих пород: 1229 п.о. (у исследуемых особей лахвинской породы он встречался с частотой 10%, у особей тремлянской породы — с частотой 10%). Однако для характеристики зеркальной отводки карпа он не пригоден, так как частота встречаемости низкая или требуется проведение дополнительных исследований на более обширном материале.
Таким образом, в результате данных исследований впервые для карпа белорусской селекции выявлены ампликоны, которые могут быть использованы для характеристики породы. В генетический паспорт породы мы предлагаем включать следующую информацию: метод генетического типирования; праймер (название, последовательность), дающий эффективные ампликоны для идентификации породы; молекулярный вес ПЦР-фрагмента, являющегося генетическим маркером породы (в парах оснований); изображение геля продуктов амплификации по данному праймеру с обозначением участков, содержащих молекулярые маркеры породы (для упрощения сравнения результатов при тестировании других особей).
Если всю вышеупомянутую информацию представить в виде математической формулы, получим следующее выражение:
RAPD – 1517N21 или RAPD – №211517,
где RAPD — метод, с помощью которого в данном случае производилось генотипирование (это могут быть также ISSR, SSR, AFLP и т.д.); №21 — сокращенное название праймера (или локуса), который использовался в генотипировании и оказался эффективным для идентификации породы, отводки и т.д.; 1517 — молекулярный вес (в парах оснований) ПЦР-фрагмента (ампликона), оказавшегося генетическим маркером породы.
Также в генетический паспорт можно добавить информацию о частотных различиях по некоторым другим ампликонам у заявленной породы.