Генотипирование больных бронхиальной астмой по ряду полиморфных генов

Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных мультифакторных заболеваний. Ежегодно количество страдающих этим недугом увеличивается на 5—6%. По сведениям профессора доктора медицинских наук
Л.А. Горячкиной, в настоящее время данный диагноз поставлен 300 млн человек в мире, а к 2025 г. прогнозируется рост этой цифры до 400 млн. Из них 57% больных — с неконтролируемым течением БА.
На развитие бронхиальной астмы влияют как внутренние, так и внешние факторы. Первые включают, прежде всего, генетическую предрасположенность к развитию аллергических заболеваний. Вторые, такие как аллергены, профессиональные сенсибилизаторы, респираторные инфекции, диета, курение, неблагоприятные социально-экономические условия, инициируют начало недуга, обострение либо затяжное течение у предрасположенных к этому заболеванию людей.
Бронхиальная астма является следствием аллергического воспаления и обусловлена сложным взаимодействием иммунокомпетентных клеток, медиаторов, приводящих к острой бронхоконстрикции, отеку бронхиальной стенки, гиперсекреции и перестройке бронхиального дерева [1]. После первичного контакта с различными антигенами (бактерии, грибы, простейшие, пыльца растений, бытовые аллергены) большинство Т-хелперов сталкиваются с элементами неспецифической иммунной системы, особенно макрофагами, естественными киллерами и тучными клетками. Установление подобного контакта и соответствующий ответ на антиген определяют генетическую восприимчивость (или предрасположенность) человеческого организма. Важную роль в иммунологическом патогенезе бронхиальной астмы имеет дифференцировка Т-хелперов после контакта с аллергеном на две субпопуляции, называемые Т-хелперами 1-го типа (Тх1) и Т-хелперами 2-го типа (Тх2).
Клетки Тх1, как правило, секретируют TNF-A, IL-2, INF-?. Путем активации макрофагов они усиливают воспалительный процесс, что также способствует уничтожению внутриклеточных патогенов. Клетки Тх2 в основном образуют IL-4 и IL-5, а также IL-6 и стимулируют В-лимфоциты к образованию антител.
Изучение генетического аспекта в развитии бронхиальной астмы — важное направление в поиске профилактических мероприятий, позволяющих избежать обострений данного заболевания. Широкое распространение получили исследования ассоциаций полиморфных аллелей генов с риском развития определенных заболеваний у разных народов мира. Каждая популяция характеризуется свойственной ей генетической структурой, то есть своими частотами встречаемости аллелей отдельных генов. В случае генов-кандидатов определенного мультифакторного заболевания у различных этнических групп риск проявления болезни зависит как от генетической структуры популяции, так и от факторов внешней среды, что может в одной популяции усиливать неблагоприятный эффект генотипа, а в другой оказаться нейтральным [2]. Такие генетические различия между популяциями носят адаптивную или приспособительную к условиям среды и быта функцию. Генетическое исследование популяции белорусских пациентов с БА проведено впервые.
На основании анализа имеющихся научных публикаций по разным этническим группам пациентов для исследования у 56 пациентов с БА были отобраны следующие гены:
• ген интерлейкина 6 (IL-6) — регуляторного белка (цитокина). Интерлейкин-6 синтезируется активированными макрофагами и Тх2 и стимулирует в основном гуморальный иммунный ответ. G/C полиморфизм в промотере гена IL-6 в позиции — 174 (rs1800795) влияет на уровень транскрипции и циркуляции воспалительного цитокина в плазме [3];
• ген фактора некроза опухолей альфа (TNF-A). Продукт этого гена — кахексин, или фактор некроза опухолей альфа, — получил свое название благодаря способности оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки, вызывая их гибель. Однако его роль в организме гораздо шире. Этот важный белок иммунного ответа организма обладает цитотоксическим, иммуномодулирующим и провоспалительным эффектом [4]. Повышенная выработка этого цитокина сопряжена с риском развития аутоиммунной патологии, в том числе бронхиальной астмы. Генотипирован -308 A/G полиморфизм в 5’-нетранслируемом районе гена фактора некроза опухоли (TNF-А) [5]. Замена G на A в позиции-308 связана с повышенной выработкой этого цитокина, что сопряжено с риском развития аутоиммунной патологии;
• гены семейства глутатион-S-трансфераз (GSTM, GSTT), участвующие в биотрансформации ксенобиотиков и некоторых эндогенных веществ. В различных человеческих популяциях с довольно высокой частотой встречаются аллели с обширными делециями в данных генах, что приводит к полному отсутствию синтеза их белковых продуктов [6]. В ряде исследований показана взаимосвязь между полиморфизмом генов GSTM1 и GSTT1 и вероятностью развития самых различных заболеваний, в том числе бронхиальной астмы [7];
• ген, участвующий в регуляции активации и гомеостаза Т-лимфоцитов (CTLA-4), связан с предрасположенностью к заболеваниям аутоиммунной природы, в том числе бронхиальной астмы. В процессе созревания Т-лимфоцитов в тимусе происходит селективное отсеивание аутореактивных клеток и их программируемая гибель (апоптоз). Важную роль в этом процессе играет цитотоксический рецептор Тл (4), задача которого — селекция и апоптоз Т-клеток с высокой аутореактивностью (повышенным сродством к собственным HLA рецепторам). Одним из привлекающих внимание исследователей является однонуклеотидный полиморфизм в положении +49 экзона 1 (+49A/G). Транзиция аденина (А) на гуанин (G) вызывает снижение функциональной активности белка CTLA 4 [8];
• ген рецептора витамина D (VDR) — внутриклеточного рецептора, который участвует в связывании активной формы витамина D. Влияние активной формы витамина D — кальцитриола, заключается не только в регуляции Ca-P обмена, но и в нормальном функционировании иммунной системы. Изучено четыре полиморфных сайта в VDR-гене, соответствующих точкам узнавания эндонуклеаз: BsmI, ApaI, TaqI, FokI [9, 10] (рис. 1).
ДНК выделяли микрометодом (для депротеинизации использовались протеиназа К, фенол, хлороформ) из высушенных пятен крови на целлюлозном носителе. Присутствие хотя бы одного неделетированного аллеля гена GSTM1 (генотипы +/+ и +/0) определялось по наличию на электрофореграмме фрагмента длиной 215 пар нуклеотидов, его отсутствие свидетельствовало о гомозиготности по нулевой аллели
(генотип 0/0). Соответствующий размер для гена GSTT1 — 480 п.н. Успешность прохождения амплификации определялась по присутствию фрагмента гена CYP1A1 размером 340 п.н. Таким образом, гетерозиготные по мутациям в генах GSTM1 и GSTT1 лица (генотип +/0) рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов GST в гомозиготном состоянии.
Для определения полиморфных аллелей генов IL-6, TNF-A, CTLA4, VDR использовали метод ПЦР/ ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) (рис. 2).
Полиморфизм генов цитокинов (IL-6, TNF-A), рецепторов Т-лимфоцитов и рецептора витамина D, а также генов семейства глутатион-S-трансфераз изучен на выборке 56 больных бронхиальной астмой, находившихся на стационарном лечении в отделении аллергологии 10-й городской клинической больницы Минска по поводу неконтролируемого течения заболевания. Результаты сопоставлялись с данными, полученными ранее на популяционных выборках, включающих до 700 фенотипически здоровых белорусов, не состоящих в родстве и проживающих в различных районах Беларуси (ДНК-банк лаборатории нехромосомной наследственности Института генетики и цитологии НАН Беларуси).
Данные проведенных исследований были обработаны с помощью компьютерных пакетов прикладных программ Microsoft Excel, Statistica 6.0. Различия между опытом и контролем считали статистически значимыми при
Р < 0,01.
Как показывает анализ данных табл. 1, по частотам генотипов и аллелей исследованных генов указанная группа пациентов с БА не отличалась достоверно от популяционной выборки здоровых белорусов, возможно, в силу недостаточной выборки пациентов.
В проанализированной популяции белорусов (697 человек) обнаружено 54 гаплотипа, различающихся аллельными вариантами четырех полиморфных сайтов гена VDR. Наиболее частый гаплотип в популяции TtAaBbFf выявлен в 8,9% случаев (табл. 2).
Распределение частот гаплотипов у больных бронхиальной астмой достоверно (Р < 0,01, ?2 = 27,65) отличалось от популяционных. Самым распространенным у пациентов с БА оказался гаплотип TtAaBbFF (17,4%). Показано, что у страдающих данным заболеванием частота гомозигот FF (36%) выше популяционной (29,1%) — различия не достоверны.
Аллель F (60%) по Fok1 у пациентов с бронхиальной астмой встречается чаще, чем в популяции (54,2%)
(табл. 3). Несмотря на то что данные не имеют достоверных различий, преимущество частоты аллели F у данных больных целесообразно изучить на большей выборке пациентов.
В результате проведенного исследования определена частота генотипов и аллелей генов GSTM, GSTT, TNF-A, IL-6, CTLA-4, VDR у больных с бронхиальной астмой и в популяции. Установлено, что существенных различий распределения частот генотипов и аллелей по генам GSTM, GSTT, TNF-A, CTLA-4 у больных с неконтролируемой бронхиальной астмой и в популяции не наблюдается. Показано, что имеют место достоверные различия распределения частот гаплотипов и аллелей по VDR гену у больных БА и в популяции. Самым распространенным у данной группы пациентов оказался гаплотип TtAaBbFF (17,4%).